Способ определения антителозависимой цитотоксичности лимфоцитов

союз соВетсихСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 725125 А 1 01 й ЗЗ/53 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯВУ ыи медицин-. амбеков и ственн Д.А.Ад дацЬ. Ятапсаг 1 за 1 оп а Ьодудепепбеп 1 се аззау аког ЫаИп 1 са цзе 1988, ч, 45, й 1, р.74-:82. ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Киргизский госуский институт(56) Оге 1 зз М 1 сЬеИ Аповоодооз ап 1 уп)еб 1 атеб с 1 тотохсау- Мед. аЬ. Яс 1 епсе,Изобретение относится к медицине, в . частности к иммунологии, и может быть использовано для характеристики функционального состояния имунной системы.Цель изобретения - упрощение и повышение достоверности способа.Способ осуществляют следующим образом.10 мл крови, полученной путем пункции вены, смешивают с гепарином (20 ед/мл), для осаждения эритроцитов добавляют 1 мл 10-ной желатины и помещают в термостат при 37 С на 30 мин., Плазму, обогащенную лейкоцитами, наслаивают на градиент фиколла-верографина плотностью 1,077 и цен-. триф 1 Гируют 45 мин при 1500 об/мин После центрифугирования взвесь мононуклеарных клеток, извлеченных из интерфазы, отмывают дважды холодной средой 199. Промытые мононуклеарные клетки затем суспендируют полной питательной средой, состоящей из среды 199 с добавлением 10 сыворотки крупного рогатого скота, Ьглю(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛОЗАВИСИМОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ(57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в различных областях клинической и экспериментальной медицины для характеристики функционального состояния иммунной системы. С целью упрощения способа в качестве клеток-мишеней используют аутоэритроциты, а регистрация их разрушения проводится:по выходу калия из разрушенных клеток-мишеней с помощью фотометри рован ия тамина (ЗОО мг/мл) и гентамицина (О,Омг/мл)., Клетки разводят до концентрациВх 10 на мл,. аутоэритроциты. Взвесь аутоэритроцитов дважды промывают физиологическим раствором, после этого аутоэритроциты обрабатывают папаином в течение 10 мин. Промывают один раз физиологическим раствором от папаина. После этого эритроциты разделяют на две пробирки А и Б. Пробирку А с аутозритроцитами инкубируют гипериммунной антиэритроцитарной антисывороткой кролика в течение 10 мин. После инкубации эритроциты промывают дважды средой 199 и суспендируют до концентрации 8 х 10 на мл, чтобы соотношение эффекторов и клеток-мишеней было 10:1.Цитотоксический тест определяют в пластиковых 96-луночных планшетах (Ленинград, завод Медпалимер), В опытные лунки в триплете добавляют по 0,1 мл аутоэритроцитов, нагруженных антителами, и5 10 15 20 25 69 - 57 79-57 30 35 40 45 50 55 0,1 мл эффекторных клеток в соответствующих концентрациях, контроль ставят в двухвариантах. Один из них - для спонтанноголизиса, где в лунке 0,1 мл аутоэритроцитов,необработанных антисывороткой, и 0,1 млэффекторные клетки. Другой для определения общего лизиса клеток-мишеней лункисодержит 0,1 мл аутоэритроцитов и 0,1 млполной питательной среды. Планшеты инкубируют при 37 С, 18 ч во влажной атмосфере воздуха с 5% СОи. По истечении этоговремени содержимое лунок отсасывают в. центрифужные пробирки и разводят 2 млфизиологического раствора, а второй контроль разводят 2 мл дистиллированной водыдля определения общего лизиса клеток-мишеней, После этого центрифугируют 5 минпри 1500 об/мин. 1 мл надосадка отсасывают во флаконы для определения концентрации калия. Степень лизиса клеток-мишеней,регистрируют по выходу калия из разрушенн ых аутоэритроцитов. Для оп ределенияконцентрации калия в надосадке применяют пламенный фотометр ПАЖ. Индекс цитотоксичности (ИЦ) вычисляют по формулеИЦ-"- . 10 О%где А - показания фотометра по содержанию калия в опытной пробе;В - показания фотометра по содержанию калия в первом контроле (спонтанныйлизис клеток-мишеней);С - показания фотометра по содержанию калия во втором контроле(общий лизисклеток-мишеней).П р и м е р 1. Больной П 34 года.Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого,Из вены путем пункции в пробирку сгепарином взяли 10 мл крови, добавили 1 мл10%-ной желатины. Кровь помещали в термостат при 37 С на 30 мин, Плазму с лейк цитами .отсасывали и помещали в 2 млраствора фиколла-верографина плотностью1,077. Центрифугировали плазму 45 минпри 1500 обмин, после чего отсасывалиинтерфазу. Клетки отмывали 2 раза средой199 и взвесь клеток помещали в полнуюпитательную среду в концентрации 8 х 10 намл. Аутоэритроциты отмывали дважды физиологическим раствором хлористого натрия и обрабатывали папаином втечение 10 мин, Отмывали один раз от папаина и разделили на две пробирки. Аутоэритроциты первой пробирки инкубировали с гипериммунной антиэритроцитарной антисывороткой кролика. После инкубации аутоэритроциты промывали дважды средой 199 и суспендировали до концентрации 8 х 10 на мл.В опытные лункив триплете смешивали 0,1 мл аутоэритроцитов, насаженных анти- телами, и 0,1 мл эффекторных клеток в соответствующих концентрациях, контроль ставили в двух вариантах, один из них для спонтанного лизиса, где 0,1 мл аутоэритроцитов, необработанных антителами, и 0,1 мл эффекторных клеток, другой для общего лизиса аутоэритроцитов, где в лунке 0 1 мл аутоэритроцитов и 0,1 мл полной питательной среды. Планшет помещали во елажну 1 о камеру с 5% СО 2 на 18 ч при 370 С. Затем иэ каждой лунки отсасывали содержимое в центрифужные пробирки и разводили 2 мл физиологического раствора, а второй контроль разводили 2 мл дистиллированной воды, Затем центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин. 1 мл надосадка отсасывали во флаконы и определяли содержание калия на пламенном фотометре ПАЖ. Результаты определения, опытная проба = 69, первая контрольная проба (спонтанный лизис) = 57, втораяконтрольная проба (общий лизис) = 79. Индекс цитотоксичностих 100% = 54,5 %,Это свидетельствует о снижении антителозависимой клеточной цитотоксичности лимфоцитов данного больного.П р и м е р 2, Больной А 43 года.Диагноз: Сепсис.Результаты определения, Опытная проба =65, первая контрольная проба(спонтанный лизис) = 57, вторая контрольная проба(общий лизис) = 79,65-57ндекс Читотоксичности 79 - 57х 100% = 36 6%Полученные данные также указывают оснижении антителозависимой клеточнойцитотоксичности лимфоцитов у больного.Преимущество предлагаемого способазаключается в том, что он позволяет упростить определение антителозависимой цитотоксичности по сравнению с прототипом,не снижая ее чувствительности и специфичности. При этом отпадает необходимость вобработке клеток мишеней. радиактивнымизотопом (Сг ), дорогостоящего оборудова-,51ния ( усчетчикоа) и специального помещения для защиты от у-облучения. Способможет применяться практически в любойклинической лаборатории для оценки функциональной активности иммунной системы.1725125 формула изобретения Составитель Р,Гуменюк Редактор М.Стрельникова Техред М.Моргентал Корректор Э;ЛончаковаЗаказ 1172 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рэушская нэб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Способ определения антителозависимой цитотоксичности лимфоцитов путем инкубирования лимфоцитов с клетками- мишенями, нагруженными антителами, с последующей регистрацией разрушения клеток-мишеней, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения достоверности способа, в качестве клеток-мишеней .используют аутоэритроциты, а 5 регистрацию разрушения клеток-мишенейосуществляют фотометрированием по выходу ионов калия.