Способ получения препарата кислой фосфатазы из дрожжей sасснаrомuсеs cerevisiae

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Ца 1 В А 1(51) 4 С 12 К 9/16, 11/04 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ колирени ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Ю.1 йпег Р. ег а 1. Риг 1 Г 1 саг 1 опо ргоГор 1 аявяесге 1.ей ас 16 рЬоярЬагаяе йгош ЬаГег я .1 еаяГ Вос 111 шег Вз.ормуз. Асга, 1976, ч429,р.274-282.ВагЬог 1 с Б. ег а 1, Рцг 111 са 1 опапй еч 1 с 1 епсе Гог 8 егегоепегу оГасЫ рЬоярЬасаяе агою БассЬагощусея сегеч 1 я 1 ае. - В 1 осйеш. В 1.ор 11 уя.Бея. Согптп, 1980, ч,95, р.404-409.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ БАССНАКОМУСЕБ СЕКЕЧТБ 1 АЕ(57) Изобретение относится к прикладной микробиологии, конкретно к способу получения ферментного препараИзобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии., конкретно к способу получения ферментного препарата, содержащего кислую фосфатаэу, продуцентом которой являются дрожжи БассНаготусея сегеч 1 я 1 ае,и может, быть использовано в микробиологической промышленности, медицине, в научных исследованиях, где имеется потребность в таком ферменте как кислая фосфатаза. та, содержащего кислую фосфатазу издрожжей (КФД). Изобретение можетбыть использовано в микробиологической промыщпенности, медицине, в научных исследованиях. Цель изобретения - повышение выхода кислой фосфатаэы в расчете на количество дрожжевых клеток и ускорение процесса,Способ заключается в том, что длясекреции кислой фосфатаэы используются иммобилиэованные в 5-107-ныйкриогель поливинилового спирта клетки дрожжей БассЬагошусея сегеч 1 я 1 ае,которые функционируют в среде состава, г/л: глюкоза 20; хлористыйаммоний 2,0; 0,2 М сукцинатный буфер с. рН 5,0 до 1 л, при 28-32 С спостоянной аэрацией в реакторе проточного типа, а из получаемого навыходе из реактора раствора препарат фосфатаэы выделяют осаждениемхолодным (от -20 до -30 С) ацетоном.Способ позволяет увеличить выходфосфатазы в 30-40 раэ и ускоритьпроцесс получения целевого продукта, 1 табл. Цель изобретения - повышение выхода кислой фосфатаэы в расчете начество дрожжевых клеток и уское процесса.Способ заключается в том, что для секреции кислой фосфатаэы исполь зуют иммобилизованные целые клетки дрожжей БассЬагошусея сегеч 1 я 1 ае, которые функционируют в среде сос - тава, г/л: глюкоза 20; хлористый аммоний 2,0, 0,2 И сукцинатлый,т :1 ЦЫ ЛС Та:10."1,р 11 и с р 1. 50 мл сустсцз 1 ц РСет ЗК,1 раКсй К;ССЗЛГОтТСС З СЕ. СтудзРтст ггг3-2 гт 8 . тсодержлгтс 1 2,-100 СГ.)С цд1, тэьС 11 ВЛог С 50 МЛ О -наго водага Раствора ВС да цо- Л УЧС 1 И 1 ) Д 13 ЦО."1 ЕР 10 т СУСГ СИ эИ КО тару Г Расо);зсазызлот заРГь 1 ца10 мк. и зажатозлЛвлот прц 70 С в гс .ение 5 111. Затем переност здмс)Г)о)ксццс Об)аз т 1, 13 холодБ 1 ци 11 с сотсмпсрлтурстй 4 С, где вт;ер)плог24 ч (пр этом происходит оттдцвл 40 т 15 3 150097 буФер (р 1 5,0) та 1 л, при 28-32 с с пастоИной дэрлццс 1 в реакторе ЦРататЦОГО ТИПД, ПРИЧЕМ КЛЕТКИ ВКЛЮ- цены 1; 5-101-цый крцогель нл основе пасивИ 110)аго спирта д из палучдсмага 1 л входе цз реактора растцарл трепдрлт 1:ислой )Ос 1)дтдзы дрожжей вда 51 от осдждсшсм холодным (-20) - (-301 С л;стопам. 10Прмецснс усдлсила 1 среды и услази й Функ циоцир Озания иммо били зовлцшх дрожжевых клеток позволяет цлр;113 п ь биосинтез црсимуществец О По ПУТИ ССКРЕШ ВО тзСКЛЕТОЧ тОЕ ПРОС" РЛНСТВа МЕЦЦО КИСЛОЙ фаС- ФЛТ 3 )в Л 1 СП 03 Ь 3 013 ЛЦЕ 1 С /Ц) Ожже 3 ЬХ к:с.так тз имс)бцп.завдццам Риде длст 13 О.3 Ма:1 ц т т т 1ц О; т и С р Ж 1 В Л Я К О ц Ц С 1 П рлцИо фср.сцтл в экстрлцсллигярной 20жт;,КОС П И)КЕ РЛВЦОВЕС:Цай 1 ОСтаЦп.;: от 30 аь 1 эт.тзолт:з,;т,абп т,ся 1 цтенСпф;КЛтдт СОКР СЦП ФСРМСЦтд, т. С.ПО".1 С 1 Т 1 роцуКТ 1;3 НОСТЬ С.ТОМЬ ВОт:та с 1;1 1:,1 с;с)1 Фос;Флтдзь ;)ттжжеи, 25) ОВ 1 С.".111 О;т;цца а ПОСЛ.ЗСТС.:1 СОСабст 13,тГ тст.1;с 1 у 13 ст 1 с 1 ию ср)к 013ФУ 1 ЦтОЦ.".Р СЛИ 1; 1 СТСМ 1 13 ЦТЗ 01,бар )тл Освт цас.1 те 111.с)б 1 Рсзэ;1.ць:.:;:Ого др 3 жс 1 крцл цл ос 10130 1 ст 1 131 т 1 тт а,: ",т СПт",; ,ПВС )Обусстоси Тот, т тддцц сОттлл;л от ) л 3 в 1 Г аи геГ 01) афлт 3 101 30ИСТОП С;ТР:ССУРай, т Га Оба.1 С.Ш ВЛЕТ,т;Л 1 о 1)Р 1 ттТЦЫС:тоц;Я Л:Я .1.,С Ет ТС 1 ттс Ги Е 1)ггттС О);С.ттС т. 1 0 Срд 2цие). 11 олучеццые частицы криогеляс вклочеццыми в цих дрожжевыми клетками трижды промывают дистиллироваццой задай и помещают в стерильный проточный реактор. Скорость подачи питательной среды состава, г/л:глюкоза 20; хлористьп аммоний 2,0;2сукцицатцый буфер (рН 5,0) до1 л, 20 мл/ч с постоянной ее аэрапей, температура 30 С. Элюдт собрдот в ахлажддемый до 4 С сборник в течение 64 ч. Фермецтцый препарат осаждают прибавлением холодного (-20 С) ацетона при соотношенииабьемов осадителя и элюата 1,5; 1.Осадок отделяют цецтрифугировациемзысупивдют в вакууме (0,1 ммрт.ст) цлд лктивировлцным углем иПРОКДЛЕЦЦЬМ ХЛОРИСТЫМ 1;ДЛЬЦИЕМ.ВЫХад 90 МГ Г)ЕЛ), "дСЛЬцая ФОСфатлзцля мстит)а т 5 т)д/ь г бенка,зыход в расчел. Ил с хаццуо биомасЭсу (цр. дутвцост 3,8 ец, дкт/10клеток.П р и м е р . 100 мп стуспецзиЛОТОК ДРажжсй Б. ССГЕттЗ.ЭЗЛЕ Шт,38 - 1 Г - П 188, садерж.тщей 2,8 109 кле -ток цлмл, смеппвлит с 100 мч157.-ИО 0 рлств )рл 1 Вт; готовят равн.)мерцуи суспецзшо, которую рдсфдсс)вы 13;тоГ пат)ци 5 ьт ИО 75 мкл Р 1 замарлжз 13 пог образны при -70 С в течепе 7,5 миц. Далее, клк в примере1, с той рдзцитей, что температур, Функциоццровдшя иммобилизованоных клеток составляет 28 С, а температура дцетоцл при асдждециибалка -30 С. Получают 210 мг прелрдтл с удельной Фосфатлзцой лктивцастью 5,2 ед/мг белка, Выходв расчете ца исхт.дцую биомассу9(продуктивность) 4,0 ед дкт/10 клетатс,1П р и м е р 3. 25 мл суспецзиидрожжевых слеток Б. Ссгеч 1 з 1 ае,шт,б 4 - 1 Г - П 188, содержащей 2,1 1 О клеток цл 1 мц, смешивают с 25 мл20 Х-лого раствора 11 ВС. Полученнуюравномерную суспензию расфасовывают по 50 мл и здморлживают образцыт)при -70 С в течение 1 О мпц. Далее,клк в примере 1, только температура Функционирования иммобилизоваццых клеток 32 С, д температура ацетона при осаждени Фермецтцогопоепарата -25"С. После отделениявыпавшего осадка его растворяют в10-кратном количестве дистиллировац 5 15ной воды, замораживают и высушиваютлиофильцо. Выход белка 45 мг. Удельная Фосфатазная активность 5,2 ед/мгбелка. Продуктивность системы вотношении кислой Фосфатазы4,3 ед акт/1 О клеток,Данные таблицы иллюстрируют выбороптимальных параметров среды инкубации, позволяющих достигнуть максимального уровня секреции фосфатазы.Увеличение концентрации глюкозыи хлористого аммония даже на 15-20%от предлагаемых значений приводит ккатаболитной репрессии и резкомуснижению (на 70 - 90%) выхода фосфатазы в среду, а уменьшение содержания субстратов в питательной средена ту же величину создает дефицитуглеродного и азотного питания клеток, что также отрицательно сказывается ца продуктивности биотехнологической системы (секция Фермента снижается почти в 2 раза) . Значения рН питательной среды также оптимальны (возможные колебания цедолжны превышать .0,2 ед. рН). Такнапример, при работе с иммобилизо -ванными по примеру 1 клетками, нопри рН среды 4,7, секреция фосфатазы снижается ца 33% по сравнениюс оптимальным рН 5,0), а при функционировании иммобилизованных (попримеру 3) клеток при рН питательной среды 5,35 уровень секрецииниже почти на 50%.Концентрация сукцицатного буфера(0,2 М) соответствует необходимомудля дрожжевых клеток уровню изотоцичцости,Данные таблицы и примеры 1-3 по-:зволяют указать оптимальные концентрации субстратов в питательнойсреде, г/л; глюкоза 20; ИН 4 С 1 2;0,2 М сукцинатный буфер (рН 5,0)до 1 л.Концентрация ПВС в его водномрастворе, предназначенном для иммобилизации дрожжевых клеток, составляет согласно предлагаемому способу 5-10%. При меньшей ( 57) концентрации полимера криогель обладает низ=кой механической прочностью, чтоприводит к значительному вымыванию05972 6 2,0 50 5 1 О 15 20 30 35 40 45 55 ПВС в исходцом растворе более 10%получается очень плотный крцгель,что затрудняет диффузию веществ,неблагоприятно сказывающуюся напродуктивности клеток в отношениицелевого продукта (опыт показывает,что, например, в случае 13%-ногогеля продуктивность клеток снижается на 41/) .Таким образом, использование предлагаемого способа изволяет повыситьвыход целевого продукта в 30-40 раз(от О, 11-0, 14 ед. акт/1 О клеток до3,8-4,3 ед. акт/10 клеток), а также ускорить процесс благодаря повышению длительности непрерывной секреции фосфатазы, а также заменеультрафильтрации на осаждение ацетоном,Формула и з обретения Способ получения препарата кислойФосфатазы из дрожжей БассЬагошусезсегек 1 зьае, включающий выделение,биомассы дрожжевых клеток, инкубацию на среде, содержащей глюкозу, источник азота и воду, в условиях, обеспечивающих секрецию кислой фосфатазы в культуральную жидкость и последующее концентрирование целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта в расчете на коли - чество дрожжевых клеток и ускорения процесса, инкубации подвергают целые клетки дрожжей, предварительно иммобилизованные в 5-10%-ный криогель поливинилового спирта в реакторе проточного типа на среде, содержащей в качестве источника азота хлохлористый аммоний и дополнительно 0,2 М сукцинатный буфер с рН 5,0, при следующем соотношении компонентов, г/л:Глюкоза 20Хлористыйаммоний0,2 М сукцинатныйбуфер срН 5,0 До 1 ла целевой продукт концентрируют осаждением охлажденным до (-20) (-30) С ацетоном.1505972 Продук"тивиостьсистемы,ед,акт/10 кл,9 Иммобилинацияпо Условия культивирования Состав питательнойсреды, г/л Томпература, С при- меруу Глюко- Н 1, С 1 СВ доза 1 л,рН СБ - 0,2 И сукцинатны "Фер,Составитель Л.Иуроиец Еедактор Н.Гулько Техред И,Ходаннч, Корректор Т.алийЗаказ 5393/27 Тираж 50 11 одписное Б 1 П 1 осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5