Способ получения туберкулезного диагностикума

СОЮЗ СОВЕТСКИХ ЦИАЛИСТИЧЕСН СПУБЛИН 19) (11)Х 61 В 10/О ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСИОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ленинградский научноисследова тельакий институт вакцин и сыворо ток и Ленинградский орденаТрудового Красного Знамени педиатрический медицинский институт(56) 1.ТакаЬавЬ У. апй КаСзцо О. ВСцйу оп СЪе Раввче НешаЕЕ 1 цСьпаС 1 оп ВеасСоп ду СЪе РЪоврйаСЫе о 1 М. ТцЪегсц 1 озоз, 2 Соп 61 С 1 опз ой СЬе ВеасСоп. - Ашег. Веч. Вевр. в 1961, Р 83, р. 386-393.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ. ТУБЕРКУЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА, включакицийкультивирование микобактерий туберкулеза, выделение и очистку фосфатидного днтигена из микробной массы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повьпаения активности целевого продукта, культивируют микобактерии С/ЯС и 7 а 1 ц, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпаривают до появления осадка, обрабатывают хлороформом и сенсибилизируютэритроциты из расчета 0,41,0 мг антигена на 1 мл 10-нойвзвеси эритроцитов.)О Полученные микробные клетки высушивают обработкой ацетоном,Высушенные ацетоном микробные клетки заливают ацетоном из расчета 60 два объема ацетона на один объем микробной массы и помещают в термостат при 38 С на 3 ч,.после чего ацетон Сливают, Эту операцию выполняют дважды. Изобретение относится к медицинеи может быть использовано для получения антигенного эритроцитарноготуберкулезного диагностикума.Известен способ получения туберкулезного диагностикума, включающий культивирование микобактерийтуберкулеза, выделение и очисткуфосфатидного антигена из микробноймассы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им каолинаОднако известный способ не позволяет получить диагностикум с высокой активностью и, кроме того, сложен в исполнении,Цель изобретения - повышениеактивности диагностикума.Указанная цель достигается тем,что согласно способу получения туберкулезного диагностикума, включающему культивирование микобактерий 20туберкулеза, выделение и очисткуФосфатидного антигена иэ микробноймассы ацетоном и метанолом с последующей сенсибилизацией им сорбента, культивируют микобактерии В/Ви 7 а 1 ч, после метаноловой очистки фосфатидный антиген выпариваютдо появления осадка, обрабатываютхлороформом и сенсибилизируют эритроциты из расчета 0,4-1,0 мг антигена на 1 мл 10-ной взвеси эритроцитов.Способ осуществляют следующимобразом.Иикобактерии туберкулеза 0/Б З 5и Ча 1 ч выращивают в отдельных матрицах, заполненных средой Линниковой и Могилевского состав среды:вода дистиллированная 200 л, гликокол 1,7 кг, аммоний лимоннокислый 40однозамещенный 1,0 кг; натрий углекислый безводный О,б кг, натрийхлористый 0,4 кг, магний сернокислый 0,2 кг, железо лимоннокислоеокисное 0,01 кг; глицерин 14 кг,ортофосфорная кислота 60-90 мл;калий Фосфорнокислый двузамещенныйО,б кг), в течение 6-8 недель при38 С. После этого проводят стерилизацию микробных культур автоклавированием текучим паром в течение 1 ч, 50Затем микробные культуры смешиваютв равных объемах, после чего для получения микробных тел культуральнуюжидкость удаляют путем фильтрациичерез асбестовые пластины. .55 Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 лметанола на 50 г клеток и встряхивают в течение 5 ч при 37 С, послечего микробные клетки отделяют центрифугированием. Эту операцию такжепроводят два раза.Кетаноловые экстракты первогои второго извлечения по укаэаннойоперации) объединяют и помещаютв вакуум-сушильный шкаф, в которомпроводят выпаривание метаноловогоэкстракта до появления осадка фосфатидного антигена, Выпаривание целесообразно проводить при разрежении 0,8-0,6 кгс/см и температуре48-52 С. Окончание операции выпаривания устанавливают либо визуальнопо выпадению осадка для чего вакуум- сушильный шкаф должен иметь прозрачное окно для наблюдения), либо повремени, предварительно установленного в зависимости от используемойаппаратуры и конкретного режима выпаривания из расчета выпаривания до1/3 объема. Выпаривание до 1/3 исходного объема метанолового экстракта достаточно для выпадания осадка Фосфатидного антигена без соосаждения примесей.Образовавшийся осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием и растворяют в хлороформе.К этому раствору добавляют два объема ацетона для осаждения фосфатидного антигена, Осажденный антиген промывают ацетоном и высушивают в вакуум-.эксикаторе.Полученный полуфабрикат (фосфатидный антиген) до проведения операции сенсибилизации эритроцитов хранят в ампулах, запаянных под азотом.Навеску Фосфатидного антигена растворяют в метаноле. Этот раствор добавляют по каплям в физраствор, после чего производят выпаривание метанола при 50 С на магнитной мешалке до первоначального объема физраствора. Таким путем получают рабочий раствор Фосфатидного антигена для сенсибилизации им эритроцитов, поскольку непосредственно в Физрастворе Фосфатидный антиген не растворяется. Объем физраствора при приготовлении фосфатидной эмульсии зависит от требуемой концентрации Фосфатидного антигена, обеспечивающей высокий титр противофосфатидных антител в соответствующих иммунных сыворотках и экономное расходование Фосфатидного антигена. Целесообразно брать такое количество физраствора, чтобы весовая концентрация Фосфатидного антигена в нем составила 0,4 1,0 мг/мл. При этом для сенсибилизации используют 10-ную взвесь формалинизированных эритроцитов в объеме, равном объему использованного для1069783 приготовления фосфатидной эмульсии физраствора. Этим савам обеспечивается сенсибилиэация эритроцитов при соотношении ингредиентов: 0,4- 1,0 мг фосфатидного антигена на 1 мл 10-ной взвеси эритроцитов.5Операцию сенсибилизации проводят соединением равных объемов фосфатидной эмульсии и 10-ный формалинизированных эритроцитов с последующим выдерживанием данной смеси в течение 14 ч при 37 С припостоянном перемешиванииЭатем производятцентрифугирование и отмывание осадка физраствором. Из осадка отмытых15Титр антител в иммунной кролитуберкулезными диагностиками,эритроцитов различными дозами. сенсибилизировацных эритроцитов приготавливают 10-ную взвесь добавлением защитной среды. В качестве защитной среды может применяться 5-ный раствор сахарозы, сахарозожелатиновый стабилизатор, 5-ный пептон или Мясопептонный бульон 1 ИПБ с добавлением сахарозы и баратно-янтарного буфера, В выбранной защитной среде целевой продукт под" вергают лиофилизации.Сведения о предпочтительности режима сенсибилизации эритроцитов и выбора защитной среды прриведены в табл. 1 и 2.Таблица 1 чьей сыворотке в РНГА с.полученными сенсибилизацией фосфатидного анаигена Доза антигена,мг на 1 мл10-ной взвесиэритроцитов Титр антител 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 0,1 0 0 0,2 0 0 0,3 0,4Таблица 2 Титр антител в иммунной кроличЬей сыворотке в РНГА сэритроцитарным диагностикумом, лиофилизированным вразличных защитных средах Эащитная среда Титры антител в зависимости от сроковхраненйя препарата при 20 С Содержание,1069783 Продолжение табл. 2 защитная среда Титры антител в зависимости от сроков хранения препарата при 20 С Содержание,фДанные табл, 1 иллюстрируют проведение операции сенсибилизацииэритроцитов барана различными дозами Фосфатидного антигена. Как видноиз табл. 1 оптимальной сенсибилизирующей дозой является 0,4-0,6 мг/мл,так как .меньшая доза не обеспечивает достаточного выявления антител,а большие дозы приводят в неэкономному расходованию антигена. 3Как видно из табл. 2, наиболеепредпочтительной для лиофилизациии хранения препарата является защитная среда следующего состава:Иясопептонный бульон, 35об.Сахароза, вес.ЪБоратно-янтарный.:буфер ОстальноеЛиофилизированный в этой среде 4 Опрепарат может храниться 3 года, тогда как при использовании других защит,ных сред срок хранения не болееб мес.Используемые в предлагаемом спосо бе штаюы являются новыми толькопо отношению к выбранному прототипу. Они используются в укаэанной техноло. гии получения туберкулина. При этом штамм РсБс является штаммом человеческого типа. Он получен иэ СШАг.Вашингтон, комиссия земледелия) и хранится в коллекции ГИСК им. Л.А.ТарасевичаШтамм 7 а 1 ц является штаммом бычьего типа. Он получен из ЦНИИ туберкулеза и хранит ся в коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Ксерокопии паспортов штаммов прилагаются.Замена штаммов произведена в связи с тем, что использовавшиеся в 60 способе"прототипе штаммы, особенно ВСЯ,приводили к выявлению антител, характеризующих, главным образом, поствакцинальный иммунитет, что снижает специфичность этого серологиГ1 ческого теста. Кроме того, достигнутое использование одних и тех же штаммов как для приготовления туберкулина, так и предлагаемого туберкулезного диагностикума, дает возможность осуществить безотходное производство одновременно обоих препаратов: при этом в технологической схеме их получения общей стадией будет культивирование продуцентов после чего из культуральной жидкости извлекают туберкулин, а из микробной массы (которая ранее являлась отходом производства) выделяют фосфатидный антиген для предлагаемого получения туберкулезного диагностикугла.Использование только одного из этих штаммов в предлагаемом способе так же, как и при получении туберкулина, недостаточно для полного выявления соответствующих антител у больных туберкулезом. Обработка Фосфатндного антигенахлороформом введена для растворенияцелевого продукта, что позволяетосвободить его от нерастворимыхв хлороформе балластных веществ,продуцируемых используемыми штаммами микобактерий туберкулеза, Приэтом важным является выпариваниеметанолового экстракта не полностью,а только до появления осадка в котором содержится Фосфатидный антиген . Экспернментально установлено,что в противном случае (т.е. приполном выпаривании метаноловогоэкстракта до получения сухого осадка) осадок приобретает темную окраску, что свидетельствует о соосаждении балластных пигментированныхвеществ, и не поддается растворениюв хлороформе. Возможно, что это требование обусловлено использованиемназванных штаммов,60 Использование в качестве сорбента эритроцитов позволяет получитьпрепарат в виде эритроцитарного туберкулезного диагностикума, так какего применяют не в РКА, а в реакции непрямой гемагглютинации (РНГЬ). 5Кроме того, эритроцитарный диагностикум подлежит лиофилизации, что увеличивает срок его годности.П р и м е р. Матрацы, предварительно простерилизованные температурной 10обработкой, емкостью 1,5 л стерильнозаполняют синтетической питательнойсредой Линниковой и Могилевскогоиз расчета по 600 мл на 1 матрац, .рН среды равен 6,9-7,1. Одну половину матрацев засевают штаммом 01/ЯС,а другую - штаммом Ча 1 ц., Выращиваниемикобактерий туберкулеза в этих матрацах производят при 38 С в течение6-8 недель. В течение этого срокаежедневно посевы просматривают длявыявления матрацев с ростом посторонней Флоры, которые отбраковываюти обеззараживают,Матрацы с 6-8-недельными хорошовыросшими туберкулезными культурамипомещают в оцинкованные ящики, вкоторых обеззараживают эти культурыавтоклавированием текучим паром втечение 1 ч при 120 С.Обеззараженные культуры смешивают З 0поштаммно путем сливания их в 20 литровые бутыли 1 в равных объемахдля каждого штамма). Для приготовле.ния фосфатидного антигена берут 1012 л смешанной культуры обоих штаммов.Смешанную культуру фильтруют через асбестовые пластины для получения микробных клеток, .которые затем .промывают 7 л дистиллированной воды 40и 3 л ацетона.После этого производят экстрагирование ацетонорастворимых компонентов путем обработки одного объемамикробной массы двумя объемами ацетона при 38 С в течение 3 ч, поистечении которых ацетон сливают.Данную операцию проводят дважды.Обработанные ацетоном клетки заливают метанолом из расчета 0,5 лметанола на 50 г клеток и помещаютна шуттель-аппарат в термостат при37.С, осуществляя встряхивание реакционной смеси в течение 5 ч. Осадокотделяют центрифугированием при факторе разделения Г = 1500 в течение 20 мин, после чего производятповторное экстрагирование метаноломпри тех же условиях.Метаноловые экстракты первогои второго извлечений объединяют ивыпаривают в вакуум-сушильном шкафу при 0,7 кгс/см и 50 С в.течение 5 ч. За это время происходитупаривание раствора до 1/3 от первоначального объема, что достаточно65 для выпадения осадка фосфатидногоантигена без соосаждения примесей.Осадок фосфатидного антигена отделяют центрифугированием при указанном режиме, затем промывают ацетоном при 40 фС, вновь центрифугируют и растворяют в хлороформе израсчета на один объем использованного метанола 0,1 объема хлороформа. К хлороформенному раствору Фосфатидного антигена добавляют двойной объем предварительно охлажденного до +4 С ацетона. Выпавший осадок фосфатидного антигена отделяютцентрифугированием при том же режиме, промывают 3 раза ацетоном и высу"шивают. в вакуум-эксикаторе при комнатной температуре в течение 48 ч.Выход сухого Фосфатидного антигенасоставляет 2-2,5 г из 50 г микробных клеток.Фосфатидный антиген )расфасосываютв ампулы по 10 мг и запаивают последние под азотом. Установлено, чтов таком виде фосфатидный антигенможет храниться 5 лет.Для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана взятуюиз ампулы навеску фосфатидного антигена 6,0 мг растворяют в 3,0 мл метанола. Этот раствор добавляют покаплям к 12 мп 0,85-ного изотонического раствора хлористого натрия,после чего производят выпариваниеметанола на магнитной мешалке при50 С до первоначального объема физраствора (т.е. до 12 мп ).Полученные 12 мл фосфатиднойэмульсии соединяют с 12 мл 10-ныхформалинизированных эритроцитов припостоянном перемешивании. При этомконцентрация фосфатидного антигенасоставляет 0,5 мг на 1 мл 10-ныхформалинизированных эритроцитовбарана). Приготовленную смесь выдерживают 1 ч в водяной бане при37 С и при постоянном перемешивании.Затем производят центрифугчрованиевзвеси при факторе разделения Г =2000, после чего осадок дважды отмывают от избытка антигена Физраствором рН 7,0-7,2,Из осадка отмытых сенсибилизированных эритроцитов приготавливают10-ную взвесь добавлением 12 млзащитной среды следующего состава:Мясопептонный бульон,об. 25Сахароза, вес.Ъ 5Боратно-янтарныйбуФер ОстальноеПолученный жидкий препарат эрнтроцитарного туберкулезного диагностикума разливают по 1,0 мл в ампулыи замораживают до -70 С, после чего препарат лиофилизируютПри указанном соотношении ингредиентов получают 12 ампул сухого10 1069783 агностики туберкулеза применяют, как правило, туберкулин, наиболее принципиальный является сравнение эффективности использования полученного препарата с туберкулином. Дан ные для сравнительного анализаприведены в табл. 3.Таблица 3 Результаты серологических реакций поосновным группам обследования Группы обследованных РНГА с применением эритроцитариого туб, ди агности кума Обследо- Полоиительвано ная реак"человек ция, В Доверительныйинтервал Больныеактивнымтуберкулезомлегких 68,72 61,99- 65874,91 54,7962,45 211 58,66 Больные с за,тихающимтуберкулезомлегких 45,7560,95 53,41 16,68- 176 51,37 32, 26 31 Нетуберкулезные больные 8,12 160 4,39- 13,49 4,11- 22,24 10,91 55 Здоровые люди6, 32.19, 03 11,60 6,33- 11221,03 12, 36 Как видно из табл. 3, всего обследовано с применением получаемого предлагаемым способом препарата 386 чел а с применением туберкули на 1106 чел. При этом РНГА с туберкулином ставили по методу Бойдена. , Среди обследованных больных туберкулезом легких преобладали наиболее трудно диагностируемые клинические Формы: диссеминированный, инфильтративный и оЧаговый туберкулез. Среди нетуберкулеэных больных преобладали ,больные с пневмониями, которые имеют дифФеренциальное значение при диагностике туберкулеза легких, 55Математическую обработку данных таблицы производили на ЭЦВМ "Минск 22". Достоверность различия в сопоставляемых группах обследованных не ниже 5-ного уровня значимости. В то же время обнаружение антифосфатидных антител что возможно с применением нового препарата) соответственно в основном активному туберкулезному процессу, в чем и состоит преимущество получаемого диагностикума перед туберкулином,Эритроцитарный туберкулезный диагностикум применяют в РНГА, тогда как препарат, получаемый известным способом; используют в реакции каолиновой агглютинации. Соответствующие данные приведены в табл, 4эритроцитарного туберкулезного диагностикума с титром в РНГА с иммунной кроличьей сывороткой 1 г 128,Впервые в мировой практике получен эритроцитарный туберкулезный диагностикум. Поскольку в настоящее время в клинической практике для диРНГА с применением туберкулина Обследо- Положитель Доверивано ная реак- тельный человек ция, % интервал12 1069783 Таблица 4 Диагностика туберкулеза постановкой РНГА с эритроцитарным диагностикумом и РКА по методу Такахаши Группы обследованных Положительная реакция, Ъркд РНГА Больные активным туберкулезогл легких 68,7 70,2 Больные с затихающимтуберкулезом легких 36,8 36,9 Нетуберкулеэные больные 24,2 10,9 Содержание антигена, Ъ Предлагаемый способ Прототип Среднее значение 2,2 2,88 2,7, 2,9, 2,7, 2,8, 2,8, 2,9 50 55 ВНИИПИ Заказ 11599/8 Тираж 688 ПодписноеФилиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул.Проектная,4 Как видна иэ табл. 4, при близкой вероятности диагностирования туберкулезной инфекции полученный препарат более чем в 2 раза реже дает положительную реакцию при обследовании больных с нетуберкулезными заболеваниями.В табл. 5 представлены сведения об активности получаемого предлагаемым способом промежуточного продукРезультаты отдельных испытаний Как видно из табл. 5, содержание фосфора в фосфатидном антигене увеличилось .по сравнению с прототипом на 24.Использование предлагаемого спо.- соба позволит организовать беэотходную технологию получения препаратов микобактерий туберкулеза.Промежуточный продукт (фосфатидный антиген) получают из микробной массы микобактерий туберкулеза, считавшейся ранее отходом производства туберкулина, поскольку туберкулин та - фосфатидного антигена, Об активности .фосфатидного антигена можно судить по содержанию фосфора в препарате выделенного антигена, Содержание фосфора в полученном антигене определяли по методу Чена.В табл. 5 приведено содержание фосфора в препаратах фосфатидного антигена, полученного известным и предлагаемым способами.Таблица 5 выделяют из соответствующей культу- ральной жидкости. Реальность осуществления беэотходной технологии подтверждается тем, что эритроцитарный туберкулезный диагностикум намечено выпускать на предприятии по производству бакпрепараФов Ленинградского НИИ вакцин и сывороток, которое является также и основный производителем туберкулина,Срок хранения предлагаемого препарата достигает трех лет, тогда как известный хранится лишь 1 год.