Способ получения антибиотика

" 663724 Союз СоветснихСоцНалистицеснихРеспублик АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 51)М Кл." 6) ) Дополнительное к авт. саид явлено 06.10.72(21) 1835325/28-1 4 12 присоединением заявки И тввнньа комнтвтСССРи нзвбрвтвннйвткрытнй Приоритет 5,79, Бюллетень )вв 1.9 убликовано 25.0 3) УДК 69((72) Авторы изобретен К Петер странное предприяФеб Иенафарм"(7 Заявит ТИБИОТ 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН Изобретение относится к способам получения антибиотиков с концеростатической и вирусостатической активностью, точнее к способам получения антибиотиков с использованием в качестве продуцента вида ЫгерСотчсеВ ч 1 ососепв5Известен способ получения антибиотика путем культивирования МгерЪоючсев что 1 асепв 1212 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода,то азота и минеральные соли, при аэрации и перемещивании с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, очисткой и хромвтографическим разделением его на активные компонен 15 ты, Однако получаемыи антибиотик недостаточно активен против микроплаэменных, вирусных и опухолевых болезней 11.Целью изобретения является получение нового антибиотика виоламицина, активного против микроплазменных втрусных и опухолевых заболеваний.Способ получения антибиотика заклю чается"в"том=, что кулътивируют продуцент.я . Эжвйе:,м--вида ЫгерСоппсеь ч 1 обасеттн 1 МЕТ 3 А 6844 в аэробных условиях на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при аэрации и перемещивании с последующим выделением целевого продукта иэ культу- ральной жидкости, очисткой и хроматографическим разделением его на активные компоненты. Способ отличается тем, что в качестве продуцента целевого продукта используют щтамм ЭЬ" ерСотпъсеВ ч 10 сОс,еп 1 МЕТ ЗА 6844 а культивирование прооводят при 25-37 С в течение двух-щести дней.Штамм коллекции щтаммов Центрального института микробиология и экспериментальной терапии в г. Иена при Немецкой академии наук в Берлине под номером 1 МЕТ )А 6844, Исходныи тип был выделен в 1958 г. из пробы земли местности Швелленбург в районе Элькслебен (Эрфурт), Штамм принадлежит к виду ЫгерСотпусев и соответствует ЫгерСотттнсеэ ч 1 а 6 осепь (Россииориа, 1891, Кра663724 сипьников, 1941, Ваксман, 1953), даваемому согласно исследованию штамма нового н типа 18 Р 5082 (ЗММЭ, Р 3 Д 656, в ДТСС 15888) в международном проекте и 8 ЬЕр 1 о 1 таизйирлинга и Готтлиба (Зп 1.Т. м Въяве Вас 1.19: 497, 1969). ф тКультивирование штамма 1 МЕТЭАп 6844, квк и его мутантов и вариантов,т осуществляется в аэробных условиях.Леофильно высушенный с землей споровый и материал штамма приливают в соответству-Е т ющие питательные вгаровые среды, а за- н тем ь жидкие, предварительно стерилизо- ц ванные питательные среды, а образовавн шийся мицелий культивируют общеизвест- т5 ным методом при температуре в пределах но о25 и 37 С (предпочтительно 28 С) вв продолжение 2-6 дней (предпочтительноэ 4 дней) при кислотности, которая к начв- л лу ферментационного процесса находится ш в пределах рН 6,2 и 7,0, а к концу 16ф между 7,5 и 8,3, Питательная среда сос- р тоит из источников углероде и азота, а также из неорганических солей, И качестве в источников углерода могут применяться р1 крахмал, глюкоза, глицерин, маннит, декст- ц рин, сахароза, соевое масло и соевая мука. В качестве источников азота, помимо н упомянутых .аэотсодержаших: субстратов, ф могут применяться также сухие дрожжи,эе мясной пелтон и каэеин. Антибиотик экстрагирует из культурвлього фильтратв органическим, не смешиающимися или мало смешивающимися, а3 мицелия органическими, смешивающиися с водой, растворителями, Иэ экстракв мицелия антибиотик реэкстрагируют сримененным для экстрвгирования кульурального фильтрвта несмешивающимсяли малосмешивающимся растворителемсоединяют с соответствующим экстраком культурального фильтрата. Полученый таким образом экстракт снова конентрируют, антибиотик переводят в водяую фазу и при рН 3,0-9,0 (предпочтиельно 8,2) снова экстрагируют с оргаическим, несмешивающимся с водой, расторителем и осаждают из концентратакстрактв по редством смешения с петроейным эфиром или бензином при перемеивании освобождают от растворителяильтрованием. Осадок растворяют в хлооформе, фильтруют от нерастворимогоосадка, раствор хлороформа промываютодой и в заключение смешивают с петолейным эфиром, причем осаждается фрвкия Д виоламицина,фракцию Д виоламицина растворяют виэших спиртах, очищают на хроматограической колонне, например с применениемСефадекса (Р) товарный знак фармацииУппсала (Швеция) и разделяют на полученный сначала виоламицин Д и на полученный из колонны биологически неактивный агликоновый комплекс виоламицинаД.фракцию В виолвмицина получают изпромывочной воды экстракта хлороформа,который подвергают экстракции при рН6-9 в бутаноле, Экстракт концентрируюти смешивают с петролейным эфиром, причем осаждается фракция В виоламицина.Ее растворяют в низших спиртах, очищают в хроматогрвфической колонне с применением Сефадекса (й) и отделяют полученный сначала виоламицин В, полученныйзатем виоламицин В, а также полученный последним биологически неактивный агликоновый комплекс виоламицинон В. Штамм обладает следующими свойствами; субстрамицелий на различных.средах и в различные отрезки времени быва 3ет окрашен в красный, фиолетовый илисиний цвет. Пигмент, который может дифундировать и в агаровые среды, облвда-))40душный мицелий окрашен в бледно-розовый, розовый или серовато-розовый цвет.Споровые цепочки расположены в болееили менее равномерной (в большинствеслучаев открытой)спирали нв частичнодлинных главных гифах,Слоровая поверхность колючая, Нв пептонсодержащих, а.также не тирозинсодержащих средах пигмент, обладающий цветом от коричневого до темно-синего, диффундирует в. агар, Штамм растет на бвзальной среде с добавкой д-глюкозы, ларабинозы, д-ксилоэы, м-инозитв, д-миннита, д-фруктозы, рамноэы, сахароэы ирафинозы,ИВыделение антибиотика виоламицинапроводят следующим образом (см, схему),Виоламицины Д, В и В различают по содержанию соединений сахара и могут быть разделены хроматографиейна бумаге на шесть различных компонентов. Гидролизаты различных виоламицинов дают одинаковую вгликоновую смесь, однако, с количественным отличием отдельных компонентов.663724511 олучение антибиотика В ОЛАМИЦИ 1 А льтурлльный фнльтрнт ( КГ) рган Экстрагирован страгирование с органическими ешиваюшимися с водой раствоческими не смешиваюшимисили мало смешиваюшнмисяводой растворителямиЭкстракт Т рителями е страгирование в водрт Экстрак Экстрагирование с органическими,не смешиваюшимися с водой растворителями Экстраг кими, н ганичесюшимися сями . в кстракт 1 И Экстракт И Реэкст ейным эфиром или О:аждение с пет бензиномрой продукт виоламицин астворение в хлорофор оламицина в хлороформе Раст 1 ромывка водой я В виоламицина ная танолом кс трагиро ванне Бутаноловый экстракт фра ой продукт виоламицина А вание с петролейнь эфиром в низших аствор ырой продукт виоламицина астворение в низших алиических спиртах Раствор виоламицина оламицин А ческ Очистка на хромаколонне нон виола Виолам иоламицинон Антибиотик вноламицин А представля обой комплекс аморфных красновато-ко рощо растворим спиртах, малон ричневыхв хлорофо етоне Экстрагирование в водн ЭкстрактОрганическая фракци амицина Смешивание с петролейныэфиром тических спиртахРаствор виоламицина А Очистка на хромотографической колонне ированиесмешив створит,7 растворим в бензоле и не растворим в эфире и воде, Виоламицин А обладает свойствами индикатора и в кислых растворах обладает красным, а в шелочйых растворах синим цветом.5Как свежие ферментационные бульоны образователей виолвмицина, так и выделенный из них антибиотик, подавляют рост грам-положительных бактерий и микро- бактерий, в меньщей мере они подавляют1 Е рост представителе й грам-отрицательных ,бактерий, с другой стороны, дрожжи и грибки не испытывают антибиотнческогог действия. Против плацентарных клеток 1 И чуо (в пробирках) и против эксйериментально вызванных опухолей у мышей виолвмицин проявляет цитостатическую, а также квнцеростатическую активность.Исследования канцеростатического действия антибиотика виоламицина.Нв первойступени канцероствтического теста (отделв экспериментальной терапии 1 МЕТ, Иена) вйоламицин-сырец проявляется на мышах, которым были введены экспериментально лейкемии Ь 1210 и ЬАТ 1, а также саркома 180 (активность в отнощении саркомы 180). При однократном введении 5 и 2,5 мкг виоламицинв-сырца нв 20 г веса мыши затормаживается рост твердой опухоли по сравнению с необработанным контрольным Приведенные в таблице результаты показывают, что виолвмицин А является бвктериостатически более активным пр- тив М.даИ 1 эерМсчм (Штамм 86), чем виолвмицин. В, зато виолвмицин В проявляет более сильную бактерицидную активность против М,1 ог 31 ля, чем виоламицин А. Оба виоламицина отличаются от известных до настоящего времени природ экземпляром на 48,9 и, соответственно, на 53,6 о.Бактериальные вирусы, квк и представители вирусов у животных, приостанавливают свой рост под влиянием внутриклеточного проникновения антибиотиков без одновременного блокирования обмена вещества клетки-хозяина. Особенно сильную активность оказывает виоламицин на деление клеток и на обмен веществ в состоянии покоя у видов микоплазмы. Исследование бактериостатического и бактерицидного действия антибиотика виоламицина нв микоплвзмы. Действие антибиотика проверяют на двух наиболее видных возбудителях эпизотии в сельском хозяйстве, в особенности в животноводстве и скотоводстве. Виоламицины А и В отличаются поразительной по силе бактериостатической и одновременно с этим и бактерицидной активностью в отношении МсорВов 1 ъа 5 аИ 1 ьЕРЫсот (штамм Д 6) нВзсорбаьпа Фрог 111 гиб. Сравнительное исследование биологической активности антибиотического комплекса вноламицина А и В, Проявляет при оценке теста разбавления на питательных бульонах следующий спектр действия (см. таблицу). ных материалов, обладающих активностьюпротив микоплазмы; своим в сотни разбольшим бактерицидным действием. Подобная биологическая активность противпредставителей микоплазм, которые могутвызвать болезненные симптомы у домашних животных, еше не была описана применительно к антрациклиновым антибио;.тикам, что является особенно ценным.П р и м е р 1. Два сосуда с прямым горлышком емкостью 500 мл содержат по 80 мл следуюшей культуральнойсреды, вес. С 6:Глюкоза 1,5Соевая мука 1,5Хлористый натрий 0,5Углекислый кальций 0,1Первичны й фосфорнокислы йкалий 0,03Водопроводная вола Остальное.оСтерилизация: 35 мин при 110 С.После стерилизации рН 69.Культуральную среду в сосудах с прямым горлышком инокулируют споровойи мицелиевой суспензией, полученной состериальным иэотоническим раствором вповаренной соли культуры-обраэователявиоламицина в возрасте 10-14 дней, выращенной в пробирке на следующей питательной среде, %:Овсяная мука 1,0Овсяные хлопья,молотые 1,0Агар-агар 2,0Водопроводная вода Остальное.оСтерилизация: 35 мин при 120 С, естественная кислотность.ВырМценные культуры выдерживают втечение 48 час при 28 С в приборе привстряхивании (180 об/мин). 8 мм полученной таким образом культуры служатдля инокуляции одного сосуда с прямым:горльидком, в котором содержится 80 млследуюшей среды, вес. %:Глюкоза 2,0Соевая. мука2,0Хлористый натрий 0,5Углекислый кальций 0,3Водопроводная вола Остальное.оСтерилизация: 35 мин при 115 С,После стерилизации рН 6,3. Температураово время ферментации 28 С, частотавстряхивания 180 об/мин.После 72 час ферментации достигаегся наивысшее содержание виоламицина125 мкг/мл. Определение активностиосуществляют известными способами,П р и м е р 2. 80 мл указанной впримере 1 жидкой среды, содержащейся всосуде с прямым горльпцком на 500 мл,инокулируют штаммом-продуцентом виоламицина. из питательной среды, как описано в примере 1. Культивируют в течение 24 час при 28 С в приборе приовстряхивании (180 об/мин). 12 мл полученного таким образом питательного бу"льона служат для инокуляции 400 мл такой же среды предварительного культивирования, содержащейся в двухлитровойстеклянной колбе.Культивируют последующие 24 часпри 28 С и при встряхивании (180 об//мин), полученные таким образом 400 млкультурального бульона служат для инокуляции 20 л среды описанной в примере 1, Эта среда содержится в 32-литровом стеклянном ферментере. Во время 10 ферментации, которая проводилась со скоростью перемешивания 400 об/мин и сподачей воздуха в количестве 15 л/мин,за пенообразованием ведется контроль добавлением небольших количеств подсолнечного масла или иных силиконсодержашихпеногасяших средств. рН 20 л культурального раствора добавлением соляной кислоты доводят до 5,0 и после отделения мицелия получают 18 л культурального фильф трата. Бутаноловый экстракт культурального фильтрата концентрируют под вакуумом в соотношении 1:10 от исходногообъема и соединяют с бутаноловым экстрактом концентрата мицелиевого экстракта. Предварительно мицелий дважды перемешивают с метанолом в соотношении1:6. Объединенные вытяжки под уменьшенным давлением концентрируют до 1/20объема метанола, а образовавшийся при Зф этом водный раствор исчерцываюшим образом экстрагируется бутанолом. Соединенные бутаноловые экстракты вместе сбутаноловым экстрактом культуральногофильтрата доводят до 1/25 объема культурального раствора. Иэ конечного концентрата получают при добавлении трехкратного объема петролейного эфира 300 гбиологически активного сырьевого продукта (А 6844) на 1 мЗ культуральной фф среды.П р и м е р 3. 200 г сырьевого продукта А 6844 суспендируют в 5 л хлороформа и после 1 час перемешиванияраствор отделяют от нерастворимого ос 43татка, Хлороформенный раствор промывают пять-шесть раэ половинным объемомводы и тем самым полностью освобождают от водорастворимых пигментов, Послевысушивания хлороформенный раствор концентрируют под уменьшенным давлениемдо 1/50 исходного объема и перемешивают с десятикратным количеством петрэлейного эфира, При этом выпадает биологически активная фракция А виоламицина. %Фракцию А отфильтровывают, промываютчистым петролейиым эфиром и высушивают под уменьшенным давлением и в экси