Способ получения экстракта абортирующих веществ

Союз Советских Социалистических РеспубликИЗОБРЕТЕН ИЯ олнительныи к патенту -(21) 2121941 (Зо) 1104 7 22) Заявлено 11.04,723) Приоритет -51) М. К А 61 К 35/ омитет Государственный к СССР по делам изобре и открытий2) Авторы изобретен ыис Нориега осе Каноджиа,чард ют л Воч Иностранная фирма1Орто Фармасьютикал Корпорейшн("ША) Заявитель 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАК АБОРТИРУЮЩИХ ВЕ(ЦЕСТВ Изобретение относится ктической промышленности иполучения лекарственных прИзвестен способ получента абоотиоуюших веществ изрода .Зоепетл путем водрагирования 11 .Однако известный способ не обеспечивает высокой активности целевогопродукта,Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.Эта цель достигается тем,чтоэкстракт обрабатывают водонесмешивающимся органическим растворителем,осадок отделяют, растворяют в органическом растворителе, обрабатываютподщелоченной водой, с последующейхроматографией, элюированием смесьюполярного и неполярного растворителя,удалением органических растворителей,хроматографией, элюированием неполярным органическим растворителем и концентрированием,фармацевкасается епаратов. ия экстрак растений ного экстняют эфир, хлороф ворителя приили бензол.Способ осразом. ествляют ледующи б 10 15 25одосмеши-.яю 1 ароЮа-ированный,фатическийского раст еств прим хлию ведут при т едпочтительно 10 мин и бол мпеприе,о ал а Кроме того, в ка вающего растворител тический углеводоро углеводород или про эфир, а в качестве Проводят водную экстракцию листьеврастений, затем экстракт обрабатываюторганическим растворителем.Предпочтительными растворителямиявляются водносмешивающиеся алифатические низшие эфиры, например метилацетат, этилацетат, бутилацетат идругие эфиры, алйфатические углеводороды, например пентан,гексан илигептан, и хлорированные углеводороды,например хлороформ, четыреххлористыйуглерод, метиленхлорид, и ароматичесфкие углеводороды, такие как. бензол,толуол, ксилол высшие водонесмешивающиеся алифатические спирты, напримербутанол или пентанол.Отбирают примерно 3,5 кг листьевэтого растения, сухих или свежих, ипромывают холбднойводой, листья можно резать на мелкие части, затем ихэкстрагируют водой, лучше горячей,или органическим растворителем, указаниьщ выше ,Водную экстракц ературе 25-100 С, пркипячении в течение ено не свыше 2-х часов, Полученный вогный слой затем отделяют от растения и получают окрашенный в темный "цвет растворйрийрймененйи"органическЬго растворителя берут равный объем соответстзующегс"растворителя при экстрагировании водной фазы (температураэк"трагйрования несколько выше, чемкомнатная) и доводят до температурыкипения данного растворителя10ЭкстРагирование органическим"растворителем ведут в течение 1-2 час,Органические экстракты ссединяютв,"лесте," выйариваютдосуха при температуре 30-80 СС, 15Продукт, получаемый при йачальной" экстракции; содержит активную основуи обладает полезной биологическойактивностью, но еще содержит ряд не" " желательных примесей. Это вещество 20очищают, Для этого в качестве исходного берут соответствующее количество веЩеСтва, полученное после водноорганической экстракции, сначаларастворяют его в органическом растворителе, полученный раствор фильтруют и промывают водным растворомслабой щелочи, например бикарбонатанатрия, карбоната натрия, ацетатайатрия, дляудаления водорастворимых З 0и кислых примесей, предпочтительноприменять насыщенный раствор основания,Органический растворитель отгоняют известным способом, а остаток пропускают через колонку с сорбентом.В качестве сорбента используют поли "мерные и сополимерные материалы, например сополимер винилацетата, раз"-"личные типы силикагеля и окись алюминия40Лучшим сорбентом является сбполимер винилацетата.Обычно собирают несколько фракций,в каждой из них определяют биологически активное вещество тонкослойной .45хроматографией. Однако, где нужноболее чистое вещество, фракции,содержащие активное начало, собирают вместеи хроматографируют на таком сорбенте,как силикагель, флорисил или окись 50алюминия,Колонку промывают органическим растворителем или смесью растворителей. К таким"растворителямотносят ся ароматические углеводороды., например бензол, толуол, ксилол, и низшие алифатические эфиры, например метилацетат, этилацетат, бутилацетат, или смеси этих растворителей, Несколько фракций собирают и активное начало снова прослеживают тонкослойной хроматографией, Фракции, содержащие нужное вещество, соединяют вместе, растворитель отгоняют и получают абортирующее вещество. 65 Полуочищенный экстракт, полученный при начальной очистке, можно дальше очистить хроматографированием на таком сорбенте, как кремниевая кислота, силикагель или флорисил, применяя смесь по 1 ярных или неполярных растворителей в качестве элюента. Лучшимсорбентом является кремниевая кислота, можно применять нейтральную иликислую кремниевую кислоту,Вещество для хроматографированиялучше сначала растворять в соответствующем растворителе, например хлороформе, затем его вводят в колонкус сорбентом в соответствующем растворителе и колонку элюируют смесьюполярного и неполярного растворителя,К полярным растворителям относятсянизшие алкильные спирты, напримерэтанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, низшие алкильные эфиры,например этилацетат, бутилацетат,алифатические кетоны, например ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетонК неполярным растворителям относятся хлорированные углеводороды,например хлороформ, углеводородныерастворители, например пентан, гексан,гептан, ароматические углеводороды,например бензол, толуол,Лучшей смесью растворителей является изопропанол - хлороформ, Собранные фракции выпаривают досуха притемпературе от комнатной до 40 С,оСостав собранных фракций прослеживается тонкослойной хроматографией,но раствор сырого экстракта хроматографируют также без отгонки растворителя,В результате очистки получаютабортирующее вещество, содержащее неменее трех основных компонентов всмеси, что доказывает хроматография.Наличие абортирующих веществ всмеси определяют по методикам, применяемым для обнаружения сокращенийматки и прерывания беременности у животных самок. Прерывание беременностиу морских свинок наблюдается при введении смеси в дозах 75-100 мг/кг. Сокращение матки обнаруживается привведении 2,5-5,0 мг/кг смеси,Очищенное абортирующее веществовыделяют из экстракта дополнительнойочисткой,Для этого исходные экстракты, изкоторых получают очищенное абортирую-щее вещество, получают из растениясерией экстракций и очисток,Листья сначала суспендируют в водеи смесь нагреВают до 98-100 С в течение нескольких часов. Горячую смесьфильтруют и Ьстаток на фильтре промывают горячей водой, Смесь фильтруютвторой раз и фильтраты смешивают.Смешанные водные экстракты несколькораз экстрагируют органическим растворителем. После разделения водногои неводного слоя органический раст-,воритель удаляют известным способом,Соответствующими растворителями"дляорганической экстракции являются несмешивающиеся с водой органическиеалифатические эфиры, например этилацетат, и бутилацетат, алифатическиеуглеводороды, например хлороформ,четыреххлористый углерод и метиленхлорид, ароматические углеводороды,например бензол или толуол,водонесмешивающиеся алифатические спирты, 10например бутанол, пентанол, гексанол;Предпочтительным является этилацетат.Остаток после удаления органическогорастворителя несколько раз экстрагируют горячим органическим растворителем. Растворитель снова удаляюти остаток промывают горячим органическим растворителем, В качестведополнительной очистки остаток растворяют в соответствующем растворителе, например ацетоне, и перемешивают с сорбентом, например древеснымуглем,Остаток после фильтрования и удаления растворителя применяют в качестве исходного вещества, из которого получают очищенные абортирующиевещества.Абортирующие свойства этих веществопределяют по измерению степени сокращения .матки и степенью прерывания бе- З 0ременности у животных самок. При желании небольшие примеси удаляют изочищенного соединения дальнейшим хроматографированием на сорбентах, например кремниевой кислоте или флорисиле. Колонку элюируют органическимрастворителем или смесью растворителей, лучшей является хлороформ - изопропанол, состав собранных фракцийопределяют тонкослойной хроматографией,Очищенные абортирующие веществаэффективны при введении дозами от1,0 мг до 100 мг/кг. Необходимая дозазависит от вида животного, которомувводят вещество, Вещество может бытьприготовлено в качестве раствора,суспензии и твердой формы.Изобретение иллюстрируется следующими примерами,П р и м е р 1. Экстрагированиелистьев органическим растворителем"с последующей водной экстракцией органического слоя 2,0 кг сухих листьев кипятят с обратной перегонкойв СНС 0 ,в течение 1 часа, После фильтрования хлороформный экстракт выпаривают досуха при пониженном давле-нии и температуре 35-50 С и получают196 г темной полутвердой массы. Этотостаток экстрагируют горячей смесью 0этанол - вода (1:2)Водно-этанольную фазу снова экс-трагируют СНС 3, хлороформный слойотделяют в выпаривают досуха при по-ниженном давлении, получают желтокоричневый сироп. Его растворяют вэфире и раствор промывают водным насыщенным раствором бикарбоната натрия,5-ным раствором едкого натрия, водой и сушат над безводным сульфатомнатрия.После испарения эфира остаетсясырой экстракт в виде желтого масла(11,9 г) .П р и м е р 2Водная экстракциялистьев с последующей экстракциейводного слоя органическим растворителем,634 г сухих листьев кипятят с обратной перегонкой с 4,0 л воды втечение 1 часа. Экстракт декантируюти экстрагируют хлороформом. ХлороФормную фазу сушат и фильтруют, растворитель отгоняют при пониженном давлении,остается 4,55 г полутвердой массы,Водную фазу снова экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу сушат надбезводным сульфатом натрия, Фильтруют,выпаривают при пониженном давлении иполучают 1,99 г, Оба остатка от хлороформа и этилацетата смешивают и получают экстракт,П р и м е р 3, Водная экстракциялистьев с последующей экстракциейводного слоя этилацетатом,140 г сухих листьев растения родаЗоепетл и 2,5 л воды нагревают собратной перегонкой в течение 1 часа,Водный экстракт упаривают до объема250 мл и экстрагируют 4 раза по 750 млэтилацетата. Экстракты смешивают исушат над безводным сульфатом натрия,После фильтрования и отгонки растворителя в вакууме получают 1,3 г темноокрашенной массы. Ее экстрагируют100 мл хлороформа, Фильтруют, выпаривают в вакууме и получают сырой остаток в количестве 0,840 г.П р и м е р 4. Экстракция листьевгексаном.966 г сухих листьев растения родаЗоепетл нагревают с обратной перегонкой в течение 3 час с таким количеством гексана, чтобы листья былиполностью закрыты, После фильтрованияи выпаривания полученной жидкостидосуха получают 56,8 г темного зеленоватого сырого экстракта,П р и м е р 5. Экстракция гексаном с последующей экстракцией органического слоя водой и с последующейэкстракцией водного слоя этилацетатом,350 г сухих листьев растения родаЗоепетл покрывают слоем гексанаи эту смесь нагревают до начала кипения в течение 15-20 мин при перемешивании. Гексановый экстракт декантируют, фильтруют и обрабатываютравным объемом воды (около 700 мл).Слои разделяют и гексановый слойснова обрабатывают равным объемомводы при перемешивании, После разделения слоев гейсановую фазу обрабатывают таким образом еще раз.Водные слои смешивают и три раза экстрагируют равным объемом этилацетата. Этилацетатные,экстракты смешивают и выпаривают досуха, получаютб,б г сырого экстракта в виде темного коричнево-желтого сиропа.П р и м е р б, Водная экстракциялистьев с последующей экстракциейактивного вещества бензолом,1 кг сухих листьев растения родаЗоепетл" нагревают с 15 л водыв течение 3 час с обратной перегонкойпри давлении 586 мм рт,ст. Водныйслой декантируют и Фильтруют черезсетку, Затем его обрабатывают 700 гактивированного угля до наступленияфлоккуляцни, Затем смесь перемешиваютв течение 2 час, быстро фильтруютв вакууме и получают прозрачный фильтрат, Отфильтрованное твердое вещество сушат в вакууме при комнатной, температуре в течение 3 дней, затемсуспендируют в 3 л бензола, При отгонке бензола отгоняется около 200 млводы, получают бензольный слой, который при упаривании досуха дает 3 гсырого экстракта в виде масла,П р и м е р 7 Водная экстракциялистьев с последующей экстракциейводного слоя этилацетатом. 2 кг свежих листьев растения родаЗоепетл покрывают слоем воды(10-12 л) и кипятят в течение 1 часа.Затем смесь фильтруют через сыруюткань в горячем состоянии и дают остыть, Водную часть дважды экстрагируют двойными объемами этилацетата, Затем этилацетатную вытяжку выпариваютдосуха при 50 С в вакууме и получают12 г темно-зеленой массы. Эту массуобрабатывают 500 мл бензола и смесьнагревают до кипения в течение15 мин. Бензольный слой декантируют,остаток промывают бензолом до прекращения экстрагирования вещества, Бензольные экстракты смешивают и выпаривают досуха в вакууме при 50 С,Получают коричневатую массу, которуюзатем последовательно экстрагируютотдельными порциями гексана до получения бесцветного гексана, Полученныйостаток, около 8 г, имеет консистенцию густого сиропа, Это веществорастворяют в ацетоне (100 мл илименьше) и добавляют 5 г активированного Угля. Смесь перемешивают прикомнатной температуре 1 час до флоккуляции угля, Смесь Фильтруют, фильтрат выпаривают досуха в вакууме прислабом нагревании (30 С) и получают4-6 г сырого экстракта,П р и м е р 8, Сырой экстракт изпримера 7 (4,33 г) растворяют вэфире (500 мл) и полученный растворфильтруют и промывают насыщеннымводным раствором бикарбоната натрия(50 мл). Эфир сушат над безводнымсульфатом натрия, фильтруют, выпари вают досуха и получают светло-желтое масло (3,4 г). Затем это масло растворяют в бензоле (50 мл) и раствор загружают в колонку, снабженную набивкой из 2 кг винилацетатного сополимера, Колонку элюируют бензолом и 5 собирают следующие фракции после отгонки растворителя,Фракция Объем (л) Остаток (г)10 5 1 0,320 0,305 3,1 5 3 4,3 0,44 Фракции по 125 мл 1-18 Хлороформ19-30 Изопропанол:Хлороформ(1:99)31-44 то же то же (1:49) Вещество из Факции РЗ (1,1 г)растворяют в бензоле (10 мл) и раствор добавляют в колонку с сухимсиликагелем (60 г), размером 1 м х25 х 2 см.Колонку элюируют смесью бензолаи этилацетата 4:1. После отбора Фракций по 125 мл каждая элюирующую смесьизменяют на бензол-этилацетат 1:1.Нужное вещество в фракциях 28-3130 определяют тонкослойной хроматографией. После отгонки растворителяиз Фракции 28 получают 0,046 г полуочищенного вещества, Фракции 29-31растворяют в хлороформе, остатокнаносят на 5 препаративных пластинокдля тонкослойной хроматографии ипластинки проявляют б раз бензоломи 3 раза смесью бензол-этилацетат4:1, Основную полосу отделяют и элюируют этилацетатом, Растворитель от 40 гоняют и получают полуочищенное вещество,П р и м е р 9, Сырой экстракт изпримера 7 (4,5 г) растворяют в эфире(50 мл), раствор фильтруют и промыва 45 ют насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (50 мл), Эфирный раствор сушат над сульфатом натрия и выпаривают досуха, Полученный остаток(3,6 г) растворяют в хлороформе50 (25 мл) и загружают в колонку с нейтральным силикагелем в хлороформе,Колонку элюируют хлороформом и смесями хлороформ-изопропанол и собираютФракции по 25 мл. Пять таких Фракцийпо 25 мл смешивают и получают однуфракцию в 125 мл, Собирают около75 таких фракций по 125 мл и выпаривают досуха в вакууме при температуре ниже 40 С,Колонку элюируют следующим образом.(1:41 7) (1:33,3) (1:28,6) (1:25) 500 500 500 45-51 (3:97)52-66 (1:24)67-75 (1:19)Фракции контролируют тонкослойнойхроматографией как в примере 8, Наоснове данных тонкослойной хроматографии фракции 49-66 смешивают, отго 6няют растворитель и получают маслянистый остаток, Остаток затем очищают нанесением на силикагелевые пре-паративные пластинки для тонкослойной хроматографии, Пластинки проявляют 10смесью изопропанол-хлороформ (2:23),основную полосу элюируют и выпари-вают, получают остаток (540 мг),Часть этого вещества весом 400 мгхроматографируют таким же образом и 15получают полуочищенное веществоввиде масла,П р и м е р 10, Сырой экстрактиз примера 7(1 г) осторожно смешиваютс эфиром (5 мл) в пробирке. Раствор 20смешивают с бикарбонатом натрия (2 мл),смесь центрифугируют и эфир отгоняют,Бикарбонатный раствор промывают двумядополнительными порциями, эфира по2 мл. Эфирные экстракты смешиваюти растворитель отгоняют. Сухой остаток смешивают с небольшим количествомсиликагеля, смесь помещают в передний конец подготовленной колонки,снаряженной силикагелем. Снаряженнуюколонку вставляют в прибор для жидкостной хроматографии и колонку элюируют с градиентом от 2,5 до 7,5 диоксана в гексане при давлении 28 атм.Колонку элюируют 25 диоксана в гексане в течение 30 мин, 5 диоксана З 5в гексане в течение 30 мин и 7,5диоксана в гексане в течение 30 мин.СобраннЫе фракции контролируют газовой и тонкослойной хроматографией,получают полуочищенное вещество. 40П р и м е р 11. 10 кг листьев растения родаЗоепетли 125 л водызагружают в резервуар из нержавеющейстали с паровой рубашкой емкостью450 л. Смесь нагревают при 98-100 С 46в течение 2,5 час при периодическомпомешивании, Горячую смесь фильтруютчерез сетку и получают чай темногоцвета в количестве 105 л, Твердыйостаток в резервуаре промывают 5017 л воды и фильтрат смешивают с полученным ранее чаем, Соединенныеводные экстракты снова экстрагируют125 л этилацетата, Смесь сиЛьно перемешивают и дают отстояться, Верхнийслой сифонируют для разрушения эмульсии и отделяют сколько можно этилацетата. К смеси добавляют еще 90 лэтилацетата и повторяют процесс. Соединенные этилацетатные экстракты выпаривают при 50 С в вакууме. Остатокэкстрагируют тремя порциями горячегоО(75-80 С) бензола. Бензольные экстракты выпаривают в вакууме при 50 С иостаток три раза промывают 8 л кипящего с обратной перегонкой гексана,Промытый гексаном остаток растворяютв 2 л ацетона и добавляют 10 г угляНухара и смесь перемешивают 1 часпри комнатной температуре. Угольотфильтровывают, .фильтрат отгоняютпри 30 С в вакууме и получают 69 гсырого экстракта,П р и м е р 12. Сырой экстракт(50 г), используемый в качествеисходного вещества, растворяют в эфире (5 л) и полученный раствор фильтруют и промывают насыщенным раствороьбикарбоната натрия (500 мл), Эфирсушат над безводным сульфатом натрия,фильтруют и выпаривают досуха, получают светло-желтое масло (44,6 г). Затем масло растворяютв хлороформе(400 мл) и раствор загружают в колонку с 2,5 кг. нейтральной кремниевойкислоты в хлороформе, Колонку элюируют хлороформом и смесью хлороформизопропанол и собирают 110 фракций,Фракции выпаривают досуха в вакуумепри температуре ниже 40 С. Колонкуэлюируют следующим образом,Состав фракций контролируют тонкослойной хроматографией (силикагель, изопропанол-хлороформ 1:12,5) и газовой хроматографией.Фракции 78-84 смешивают и растворитель отгоняютв вакууме и получают маслянистый осадок (5,1 г), который содержит не менее трех основных компонентов. Часть осадка (3,2 г) растворяют в бензоле (50 мл) и раствор загружают в колонку с винилацетатным сополимером в бензоле. Колонку элюируют бензолом и собирают 47 фракций, Для контроля состава фракций применяют тонкослойную и газовую хроматографию.Предлагаемый способ обеспечивает получение абортирующих веществ с высокой активностью./Ф М У - Жз ъЗаказ 833/55 Тираж 671 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5 Филиал ППП фПатент, г.ужгород, ул.Проектная, 4 1, Способ получения экстракта абортирующих веществ из растений рода Зоепетл путем водного экстрагирования, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, экстракт обрабатывают водонесмешивающимся органическим растворителем, осадок отделяют, растворяют в органическом растворителе, обрабатывают подщелоченной водой, с последующей хроматографией, элюированием смесью полярного и не- полярного растворителя, удалением органических растворителей, хроматографией, элюированием неполярным органическим растворителем и концентрированием.2, Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве водосмешивающего растворителя применяют ароматический углеводород, хлорированный углеводород или простой алифатический эфир.3, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, чтов качестве органического растворителя применяют эфир, хлороформ или бензол. Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРР 259878, кл. Я 07 с 43/00, 1968,