Способ получения 9 -гидроксиандрост-4-ен-3, 17-диона

(9)51)5 С 12 Р ЗЗ/00 УДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНООМСТВО СССРСПАТЕНТ СССР) ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТ МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ арм (ОО) е, Бирке ОКСИ(5 А ская про- окоактивго типа.как такоина и по(ПАВ) в ю фермен-.микробио-. н ам бу пол 7-диопутем 9-ОН- для полтв, Иэ ысокоа, имевыае 1(7 ) Народное предприятие йена(7 ) Зайдель Лотар, Херхольд КлеМ хаэль и Ноак Дитер(00)(5 ) Р - Коса 1, М 52-57161,к . С 07. 1/00,1977. 1 Р КоМа 1, ЬЬ 55 85397, С 12 Р 33/06, 1980. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 9 а-ГИ ДРОСТ- Е Н,17-.ДИОНАИспользование: фармацевтич шленность для получения выс х стероидов прегнаново щность изобретения: стерин -или в виде препарата из стер хностно-активного веществ тношении 10:1 вносят в водну ионную среду и подвергают ической трансформации. :Изобретение относится к спосо ния 9 а -гидроксиандрост-ен-З, 9-ОН-АД) из .стеринов кробиологического превращенияявляется ключевым продуктом ния стероидных активных вещес го продукта могут быть получены в ивные стероиды прегнанового ряд ие широкие области применения Целью изобретения является и Йе выхода целевого продукта.Сущность изобретения. МусоЬас(ег 1 вп) чассае 21 МЕТ 11052 или штаммом МусоЬастегоп) чассае 11053, В качестве ПАВ используют блочные сополимеры полиэтиленоксида(полипропиленоксида с содержанием 30-70 полиоксипропиленгликоля или аддукты полиэтиленоксида) полипропиленоксида ч, М -тетра-(оксипроПпил-пропиол)-й -(2-оксипропил)- 1диэтилентриамина. Стерин вводят в питательную среду в концентрации от 1 до 25 г/л. При необходимости в ферментационную среду добавляют сорбент типа органического полимера в концентрации от 10 до 160 г/л. Затем сорбент отделяют от культу- ральной жидкости, элюируют ацетоном и целевой продукт выделяют путем перекристаллизации. В качестве сорбента используют полимер, полученный из этилвинилового и дивинилового бензола без полярных групп или с полярными группами на основе акрилового эфира. Получают продукт с хорошим выходом при непродолжительной ферментации с использованием непатогенного штамма микроорганизма, 6 з,п, ф-лы, 3 табл,В основу изобретения положена задача описания усовершенствованного микробиологического способа получения 9 а-гидроксиандрост-ен,17-диона(9-0 Н-АД), который позволяет получить этот продукт при высокой производительности превращения стеринов и существенно более коротких продолжительностях ферментации с хорошим выходом.Согласно изобретению эта задача решается способом микробиологической трансформации штаммами рода МусоЬас(еговчассае так, что для трансформации данногостерина или смеси стеринов используютсяштамм М. чассае ЕМЕТ 11052 или штамм М.чассае ЛМЕТ 11053. Используемые согласно изобретению штаммы депонированы вместе депонирования микроорганизмовГДР, Центральном институте микробиологии и экспериментальной терапии Академии Наук ГДР, Бойтенбергштрассе 11,ГДР-Йена 6900, эа вышеуказанными номерами регистрации.Характеристика штаммов.Штаммы МусоЬассегШгп чассае ЕМЕТ11052 и МусоЬастегцгп чассае 2 МЕТ 11053были проселектированы в отделе микробиологии стероидов института ЦИМЭТ/Йенаи депонированы в отделе депонированияштаммов института ЦИМЭТ,Морфология.После засева косяков(среда примера ч.1) микроорганизмами штамма М. чассаеЕМЕТ 11052 или 11053 и четырех-пятидневного инкубирования при 28-37 С образуется плотный бактериальный газон от желтогодо оранжево-желтого цвета, Окрашиваниепроисходит особенно быстро и интенсивнопод действием света, но имеет место такжев полной темноте (скотохромогения), Массабактерий штамма М, чассае ЕМЕТ 11052имеет гладкую влажную и блестящую поверхность. Поверхность массы бактерий штамма М. чассае ЕМЕТ 11053 имеет сухуюкрошащуюся структуру, На микроскопическом изображении клетки двух штаммов после поверхностного культивирования непроявляют заметных различий, Они имеютдлину в 1-4 мкм и ширину в 0,5 - 0,8 мкм,иногда слегка изогнуты и имеют легкое утолщение концов. Можно наблюдать короткиецепочки и клеточные грозди.После выглакивания микроорганизмыобоих штаммов отличаются друг от другаморфологией колоний.Мус. чассае ЕМЕТ 11052 (Я-форма): колонии круглые, выпуклые, с гладким краем,, с влажным блеском, желто-оранжевого цвета, диаметр около 2 мм,Мус. чассае 2 МЕТ 11053 - (г-форма), колонии круглые с неравномерным краем, плоские крошащиеся, тупые, желтоватого до бежевого цвета, диаметр около 7 мм.Находясь в жидкой культуре, штамм Мус, чассае ЗМЕТ 11053 обращает на себя внимание сильным агрегатообразованием,Употребление углеводородов и сахарных спиртов микроорганизмом штамма МусоЬастегогп чассае ЕМЕТ 11052 и МусоЬас 1 егопт. чассае ЕМЕТ 11053 приведено в табл, 1.тилентриамина,Ферментацию целесообразно провести на стадиях предварительного и основного культивирования, ее проводят при темпера 40 турах 25 - 35 С в течение 48-96 ч, причем величину рН подбирают в пределах 6,0-9,0.Далее при необходимости в ферментационную среду добавляют либо сначала, либо в течение культивирования сорбент типа 45 органического полимера в рабочей концентрации 10-160 г/л. 50 В частности при вариантах способа с использованием сорбентов применяют органический полимер, возникший иэ этилвинилового и дивинилового бензена, с полярными группами, в частности, полярны 55 ми группами на основе эфиров акриловойкислоты.Ферментацию можно провести в круглых колбах и широкогорлых склянках различной вместимости, в стеклянных ферментаторах с мешалкой, а также в аппаАмидазная активность штаммовМусо Ьастег о гп час сае 2 МЕТ 11052 иМусоЬассегов чассае ЕМЕТ 11053 приведена в табл. 2.5 Для целей согласно способу по разнымвариантам изобретения в аэробных и стерильных условиях культивирования ферментируют штамм М. чассае 2 МЕТ 11502или штамм М. чассае 2 МЕТ 11053 в водной10 питательной среде, содержащей наряду состерином источник углерода (как например,глицерин, глюкозу, сахарозу, крахмал илилактозу), источник азота (как, например,дрожжевой экстракт, мочевину или гидроли 15 зат казеина), а также минеральные соли,Для этой ферментации применяют такиестерины, как ситостерин, холестерин, кампестерин, стигмастерин или эргостерин илисмеси этих стеринов. Стерин вносится в20 водную ферментационную среду либо кактаковой, либо в виде препарата из стеринаи поверхностно-активного вещества (ПАВ),причем рабочую концентрацию стеринаподбирают в пределах 1,0 г/л до 50 г/л ферментационного раствора. Применяемыепри необходимости препараты иэ стеринаи ПАВ подготавливают, смешивая данныйстерин способом мокрого помола, лиофилизации или распылительной сушки с ПАВ на 30 зываемых ниже групп А или В, причемдолевая часть ПАВ в готовом препарате составляет 1,0-2,0 мас,,Под ПАВ групп А или В понимают блочные сополимеры полиэтиленоксид(ПЭО) по 35 липропиленоксид (ППО) с удельным весом30 - 70 полипропиленгликоля илиПЭО/ППО-аддукты И,М -тетра(оксипропиляпропион)-М -(2-оксипропил)-диэ 1837073ртах из коррозиестойкой стали. По окончан 4 и ферментации образовавшийся 9-ОНА получают по варианту способа безс рбента, собственно известным образом,э страгированием органическими раствор телями, предпочтительно бутилацетатом,с оследующей кристаллизацией,При варианте способа с использование сорбента очистку начинают с отделенияс рбента от культуральной жидкости, преди чтительно путем фильтрации, а 9-ОН-АДи лучают, наконец элюированием сорбентао ганическими растворителями, такими,к к метанол, этанол или ацетон или же водн ми растворами таких средств, концентр рованием элюата примерно до 10и ходного объема с повторной фильтрац ей, а также перекристаллизацией,В предпочтительном варианте способа,и и котором ферментировали клетки штамм 2 МЕТ 11053 в среде с добавкой 140 г/лс рбента вышеуказанной характеристики вте ение 96 часов при 28 С, в зависимости оти именяемого количества стерина в масата е круглой колбы был получен выход 9- 25О -АД в .пределах 35 - 50 мас.(а алитические значения), причем было уста овлено остаточное содержание стеринам нее 5 вес. о. Как оказалось, в этих услови х способа используемый сорбент вышеук занной характеристики оказывает нето ько благоприятное влияние в отношенииоч стки получаемого 9-ОН-АД, более того, врезультате достигается повышенное образо ание продукта, и тем самым, повышенн е использование стерина. Обобщая,м жно сказать, что преимущества способаза ючаются в том, что продукт 9-ОН-АДм жет быть получен при небольшой продолж тельности времени ферментации и с хор шим выходом при использованииш амма микроорганизма, классифицирова ного как непатогенного, и что при вариан е способа с добавкой сорбента продукт9- Н-АД не только удаляется из культурально жидкости, но дополнительно достигаю я еще и более высокие выходы продукта(с . табл. 1).П р и м е р 1. МикроорганизмыМ ОЬассегот чассае ЕМЕТ 11053 культиви уютвтечение 7 дней при 28 С наагарово косяке следующего состава: 20 ггл церина 5 г бакто-пептона, 5 г мясного5 г агар-агара, дистиллирована 1000 мл, рН 7,0 (культура в55 5115 эк тракта, 1 НО ВОДЫ Н пр бирках)., Смытыми клетка евают круглодонт ю 500 мл,содержо жидкости след и пробирки вместимол питательстава: 10 г и каждоые колб иепо 50 ющего соры од глицерина, 10 г дрожжевого экстракта, 0,5 г КН 2 РО 4,1,5 г (йН 4)2 ВРО 4, 0,2 г М 9304 х х 7 Н 20, 0,01 г Ге 304 7 Н 20, 0,002 г Еп 304 х х 7 Н 20, дистиллированной воды на 1000 мл, рН 7,0.Через 72 ч встряхивания на круговой качалке при 200 об/мин и 28 С используют по 5 мл этой предварительной культуры для засева ферментационной культуры.Десять круглодонных колб вместимостью 500 мл загружают каждую 7 г сырого сорбента типа органического полимера (возникшего из этилвинилового и дивинилового бензена, с полярными группами на основе эфиров акриловой кислоты), 10 мл препарата из ситостерина и ПАВ (100 г ситостерина, 10 г ПАВ группы В, дистиллированной воды на 1000 мл, мокрого помола) и 50 мл ферментационной среды. В качестве ферментационной среды используют раствор из 5 г глюкозы, 10 г дрожжевого экстракта, 1,3 г К 2 НРО 4 ЗН 20, 1,5 г (МН 4)2 НР 04, 0,2 г М 93047 Н 20, 0,01 г РеЯО 47 Н 20, 0,002 г ЕпЯО 4 7 Н 20, дистиллированной воды на 1000 мл, рН 8,0,Подготовленные таким образом колбы стерилизуют в течение 20 минут при 120 С и засевают после охлаждения, после этого осуществляют 96-часовую ферментацию на круговой качалке при 200 об/мин и 28 С.Общий выход, определяемый способом тонкослойной хроматографии, составлял в среднем на круглодонную колбу 330 мг 9- ОН-АД.П р и м е р 2, В соответствии с условиями примера 1 по культуре в пробирках и предварительной культуре культивируют микроорганизмы штамма МусоЬас 1 егОа чассае 7 МЕТ 11052.Десять круглодонных колб вместимостью 500 мл загружают каждую 4 г сырого сорбента вышеуказанной характеристики, 500 мг препарата из ситостерина и ПАВ (500 мг ситостерина, 50 мг ПАВ группы В, растворенные в бензене и лиофилизированные) и 50 мл ферментационной среды состава согласно примеру 1.Выход 9-ОН-АД составлял в среднем 90,6 мг на круглодонную колбу после 96-часовой ферментации на круговой качалке приП р и м е р 3. Микроорганизмы штамма МусоЬастегцт чассае ЕМЕТ 11053 выращивают в соответствии с условиями примера 1 на пробирочной и жидкой предварительной культурах.Условия для ферментационной культу- подбирают по аналогии с примером 1,нако отпадает добавка сорбента.После 96-часовой ферментации на круговой качалке при 200 об/мин и 28 С былополучено в среднем 120 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу.П р и м е р 4. Культивирование микроорганизмов штамма МусоЬадегца чассаеЕМЕТ 11053 осуществляют на пробирочнойи жидкой предварительной культурах в соответствии со стандартом, названным впримере 1,В десять круглодонных колб вместимостью 500 мл помещают по 5 г сорбента типаорганического полимера (возникшего изэтилвинилового и дивинилового бензена,без полярных групп), 5 мл препарата из ситостерина и ПАВ вышеуказанного состава и50 мл ферментационной среды (состав какпо примеру 1).Ферментацию осуществляют в течение72 часов при 28 С на круговой качалке послестерилизации колб при 120 С в течение 20минут и последующего засева.Из культуральной жидкости и сорбентаполучают в среднем по 108 мг 9-ОН-АД накруглодонную колбу.П р и м е р 5, Микроорганизмы штаммаМусоЬастегцв чассае 2 МЕТ 11053 предварительно выращивают согласно условиямпримера 1 в культуре в пробирках и жидкойкультуре. Условия для ферментационнойкультуры выбраны по аналогии с примером1, однако препарат из ситостерина и. ПАВсодержит ПАВ ферман (блочные полимерыполиэтиленоксида/полипропиленоксида ссодержанием 30-70 О полипропиленоксида, .выпуск комбината "Хемише Верке Буна").После 96-и часовой ферментации накруговой качалке при 200 об/мин и 28 Собразуется в среднем 295 мг 9-ОН-АД накруглодонную колбу.П р и м е р 6, В таких же условиях, какуказано в примере 1, вместо 7 г сорбентаиспользуют только 1 г сорбента на круглодонную колбу, Средний выход 9-ОН-АД составляет 170 мг 9-ОН-АД на круглодоннуюколбу.П р и м е р 7. В таких же условиях, какуказано в примере 1, вместо 7 г сорбентаиспользуют 10 г сорбента на круглодоннуюколбу. Средний выход 9-ОН-АД составляет310 мг 9-ОН-АД на круглодонную колбу,П р и м е р 8. Ферментационные смеси,содержащие 5 г сорбента на круглодоннуюколбу, 3 мл суспензии ситостерина и исполь зуемые в таких же условиях, как указано в примере 1, дают средний выход 9-ОН-АД в 135 мг на круглодонную колбу.П р и м е р 9. В остальном в таких же условиях, как указано в примере 1, исполь зуют 10 г сорбента и 13 мл суспензии ситостерина. Формула изобретения 1. Способ получения 9 а-гидроксиландрост-ен,17-диона путем микробиологи 10 ческой трансформации стерина микроорганизмом вида МусоЬас 1 егца чассае в аэробных и стерильных условиях в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, о.тл ича ющийся тем,чтодлятрансформации используют штамм МусоЬастегца часс ае Е М ЕТ 11052 или штамм МусоЬасегцв чассае Е МЕТ 11053.2. Способ поп,1, отл и чаю щи йся тем, что стерин вводят в виде препарата из ситостерина и поверхностно-активного вещества в соотношении 10:1.3, Способ по пп. 1 и 2, отл ич а ющий с я тем, что в качестве поверхностно-ак 30 тивного вещества используют вещество из группы аддуктов полиэтиленоксида (полипропиленоксида) й,й -тетра(оксипропилпиропиол)-й -(2-оксипропил)-диэтилентриамина.5. Способ по пп, 1-4, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что стерин вводят в питательную 35 среду в концентрации от 1 до 25 г/л, 6. Способ поп,1, отличаю щийся 40 тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, трансформацию проводят в присутствии сорбента, представляющего собой органический полимер, в концентрации от 10 до 160 г/л, затем сорбент отделяют от культуральной жидкости, элюируют ацетоном и из элюата перекристаллизацией выделяют целевой продукт.7, Способ по пп. 1-6, о т л и ч а ю щ и й 45 с я тем, что в качестве сорбента используют полимер, полученный из этилвинилового и 55 15 20 25 тивного вещества используют вещество из группы блочных сополимеров полиэтиленоксида (полипропиленоксида) с содержанием 30-700 полиоксипропиленгликоля.4. Способпопп,1 и 2,отлич аю щий с я тем, что в качестве поверхностно-акдивинилового бензола без полярных группили с полярными группами на основе акри- .лового эфира.-рамнозаальтоза езоиноэит Таблица 2 Амиды 11053 11052 Фцетамид енэамид очевина глеводороды или сахарныепирты-сорбит -маннит эоникотинамид Цикотиндмид иразинамид (алициламид /ллантоин (укцинамиДМалонамид МусоЬастегот чассае ЕЗМЕТ МусоЬастег цв чассае 2 МЕТ1837073 12 Таблица 3 Перечень параметров продуктивности при получении 9-ОН-АД при помощи штаммов МусоЬастег 1 цт чассае 21 МЕТ 11052 и 21 МЕТ 11053 по сравнению с опубликованным состоянием техники Сорбент(г/л) Штамм Масштаб Начальная концентрация сито" Публикация Время ферментации (ч) стер и на(г/л) М, чассае 500-мл 21 МЕТ кр. колба по 50 мл 140 11053 20 Пример 1 96 6,6 М. чассае 500-мл кр. колба по 50 мл 21 МЕТ 80 10 96 Пример 2 11052 1,8 М. чассае 500-мл кр. колба по 50 мл 20 96 Пример 3 2,4 500-мл кр, колба по 50 мл 100 10 72 4,2 Пример 4Патент М. чассае Склянки на 11 С)-1104 качалке11053 20 200 0,83 МЛогсч 1 тот 500-л 10 336 ВРедактор Заказ 2855 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101