Способ получения -амилазы
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
); .) ":;1,.13 1. 23но-исс ледов т Мик айоров ельсб" исти Н,В,в,микроорганиза, 1987,Амилазыкова дум а Г.А. Фермен М.: Наука, 19 ы микроорга 3, с. 250-2 ЗЫ к биотехию Фермен ышение ст ение очи для ии хол ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЗНРМТИЯМПРИ ГКНТ СССР Н АВТОРСКОМУ Сви(57) Изобретение относитсянологии, а именно к получентов, Цель изобретения - повпени очистки фермента. Полущенной о -амилазы необходимчения ее роли в иммунитете Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению ферментов, и может быть использованс в научной и лабораторной практике.Целью изобретения является повышение степени очистки фермента,Способ получения Ы-амилазы содер;жит культивирование . холерных вибрионов классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569 В в ре" акторе-ферментере, щелочной лизис при рН 10,5, нейтрализацию кислотой, инактивацию культуры холерных вибрионов мертиолатом, центрифугирование, Фракционирование супернатанта сульре. Способ получения амилазы заключается в культивировании холерных вибрионов классического биовара, серовара Инаба, штамма 569 В в реакторе-ферментере в условиях аэрации глубинным методом, лизисе клеток 0,27.-ным едким натрием при рН 10,5 нейтрализации среды доведением рН до 8,0 4,4 Е-ной соляной кислотой, инактивировании культуры 0,17.-ным мертиолатом, центрифугировании реакторной жидкости при 6000 я, насыщении надосадка, содержащего фермент, сульфатом аммония до 0,6, центрифугировании при 6000 д с целью получения осадка, обессоливании растворенного в трис-НС 1 буфера осадка на колонке с акрилексом Ри гельхроматографии обессоленного препарата на колонке с биогелем АМ в 0,005 М трис-НС 1 буфера рН 7,6. 1 ил; (" 1 О табл,фатом аммония, хроматографическое обессоливание и очистку методом гель- фильтрации на колонке с биогелем АМ.На чертеже приведен характерный тип хроматографического профиля.П р и м е р 1. В качестве источника фермента применяют холерные вибрионы классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569 В. Выращивают холерные вибрионы в реакторе-Ферментере в течение 10 ч в условиях аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментативного гидролизата казеина, содержащего200 мг аминного азота, 2% пептона;0,5% ИаС 1; 0,05% двузамещенного Фосфата натрия, рН 8,0, Культивированиевибрионов продолжают до концентрации55-5 млрд микробных клеток в 1 мл.Культуру клеток обрабатывают щелочью. Максимальный выход наблюдаетсяпри концентрации щелочи 0,2%, что соответствует конечному значению рН10,5, при экспозиции 18 ч,Для доведения рН среды до исходного значения 8,0 щелочь нейтрализуютНС 1 в конечной концентрации 4,4%.Значения степени очистки амилазы(по конечному результату) в зависимости от концентрации ИаОН и временико такта приведены в табл, 1,Показатели жизнеспособности холерных вибрионов при числе опытов 5 взависимости от концентрации мертиолата приведены в табл, 2.Инактивирование жид ой реакторнойкультуры холерных вибрионов проводятметиолатом. Оптимальной являетсяконцентрация 0,1%.Выбор концентрации 0,1% обусловленповышением надежности действия мертиблата, так как при 0,08% инактивирование культуры не происходит. Увеличение дозы свыше 0,11% не изменяет30бактерицидного действия, однако приэтом происходит повьппенный расход дорогостоящего препарата,После инактивирования жидкой реакторной культуры и постановки тестов, 35подтверждающих ее стерильность ( всоответствии с требованиями режимаработы с возбудителями особо опасныхинфекций), культуральную ходкостьцентрифугируют для отцеления осадкаклеток вибрионов.Влияние условий центрифугированияна эффективность формирования осадкапри числе опытов 3 показано в табл,3,Оптимальным режимом при отделении 45клеток из культуральной жидкости является центробежное ускорение 4000 п.6000 д в течение 25-30 мин, При 4000 ячеткий осадок клеток формируется начи.ноя с 30 мин; при 5000 д - с 25 мин; 50при 6000 е - с 15 мин. В целях сокращения времени и экономии электроэнергии для отделения клеток от культуральной жидкости используют ускорение6000 я в течение 15 мин,55Центрифугирование проводят при температуре не вьппе 4 С,После центрифугирования осадок, содержащий разрушенные клетки, отбрасывают, надосадок, содержащий фермент,переносят в трехлитровую емкость идобавляют к нему сульфат аммония до60% насыщения (на 1 л надосадка 390 гсухой соли), растворяют, перемешиваюти оставляют для формирования осадкапри комнатной температуре на 6 ч. Указанные условия являются оптимальнымис точки зрения конечной степени очистки еРезультаты эффективности очисткиамилазы (по конечному результату) причисле опытов 3 в зависимости от концентрации (ИН) БО и времени контакта приведены в табл, 4.Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, Оптимальными условиями центрифугирования являются6000 д в течение 10 мин (табл. 5). Центрифугирование проводят при 4 С, число опытов равно 3,Отделившийся осадок растворяют в0,005 М трис-НС 1 буфере, рН 7,6-7,7в соотношении 1;1 и наносят на колонку с акрилексом Р. Указанные молярность и рН буфера подобраны экспериментально и являются оптимальными(табл. 6), количество опытов равно 3.Соотношение объемов буфера и осадка, выбранное для растворения последнего, также установлено экспериментально, Самая эффективная (104 раза)очистка амилазы по конечному результату достигается именно в таком соотношении. При избытке буфера, т,е. превынении объема осадка в 1,25; 1,5;2 раза и более, эффективность очистки соответственно составляет 90; 76;68 и менее раз. При недостатке буфера, т.е. если объем в 1,25; 1,5; 2и т.д. раз меньше, чем объем осадка,эффект очистки амилазы снижается исоответственно составляет 96, 86 и 58раз, При объеме буфера меньшем объема осадка более, чем в 2 раза, отмечается лишь частичное растворение последнего, а следовательно, и невозможность нанесения образца на хроматографическую колонку,Обессоливание проводят на колонке с акрилексом Р, Указанный тип биогеля выбран потому, что только при его использовании происходит эффективное разделение (обессоливание) белкового осадка на ферментсодержащую и низкомолекулярную фракции. Сбор элюата производят под контролем оптической плотности при длине волны 280 нм1573( с помощью проточной спектрофотометрической кюветы.При обессоливании из колонки выходят 2 пика: белковый, Ферментсодержащий и солевой (содержит сульфат аммония, мертиолат и др.).Условия проведения хроматографиина колонке с биогелем Р: характеристика биогеля: пределы фракционирования по мол. м. 3000-60000 а,е,.м.;размеры колонки 75 х 200 мм; объемгеля 500 мл; скорость элюции 350400 мл/ч; рабочий буфер 0,005 М трис-НС 1, рН 7,6. .15Хроматографическую колонку с акрилексом Руравновешивают тремя объемами указанного буфера. Наповерхностьнаносят 150 мл растворенного в буфере.ферментсодержащего осадка,20.Полноту обессоливания оцениваюткачественной реакцией элюата с насыщенным раствором хлористого бария.После того, как основная часть обессоленного ферментсодержащего белка вы ходит из колонки, производят отборэлюата по 0,2-0,5 мл. К этому объемудобавляют 1-2 капли раствора хлористого бария. При образовании белого осадка, указывающего на наличие ионов БО,З 0сбор элюата прекращают,Процент потери на колонке при обессоливании рассчитывают по соотношениюобщего количества нанесенного и.полученного после обессоливания ферментного белка (число опытов 3, табл. 7).35Потери по белку составляют 33, поактивности потерь не было.Напротив,отмечается увеличение активности ами.лазы на 105 , т.е. приблизительно в 40два раза.На заключительном этапе полученияамилазы применяют гельхроматографиюна колонке с биогелем АА. Гельвыбран в связи с тем, что только он45обладает эффектом разделения бессолен-.ной ферментсодержащей белковой смеси(табл. 8)Условия проведения хроматографиина колонке с биогелем АМ: характеристика биогеля: предел исключения50по белку до 150 млн а.е.м.; размерыколонки 45 х 400 мм; объем геля550 мл: скорость элюции 30 мл/ч; рабочий буфер 0,005 М трис-НС 1, рН 7,6.Биогель уравновешивают тремя объе"мами указанного буфера, На поверхность)25 бнаносят 45 мл обессоленного Ферментсодержащего раствора. Фракции по5-7 мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую фракцию изучают на содержание белка (по поглощению длиныволны при 280 нм и более объективнопо методу Лоури) и на активность амилазы, Из колонки выходят три белковыхпика, склон первого пика содержит фермент амилазу,В табл, 9 указаны результаты очистки на разных этапах при числе опытов,равном 30,Конечной формой хранения очищеннойо-амилазы является раствор, охлажденный до 4 СВ растворе элюирующегобуфера в таких условиях препарат может храниться до четырех месяцев, сохраняя исходную активность, при комонатной температуре (20-25 С) наблюдается потеря ферментативной активности (число опытов равно 3, табл. 10). Формула изобретения Способ получения с -амилазы, заключающийся в обработке исходного мате-.риала, фракционировании экстрактасульфатом аммония, центрифугированииосадка с последующим обессоливанием,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повьппения степени очистки фермента, в качестве исходного материала используют холерные вибрионы классического биовара, серовара Инаба,вакцинного штамма 569 В в концентрации(55-65) 10 З клеток/мл, лизируют их едким натром при значении рН суспензииклеток 10,5 в течение 18 ч для выхода фермента из периплазматическогопространства в культуральную жидкость,нейтрализуют среду доведением рН до8,0 соляной кислотой, инактивируюткультуру 0,09-0,112-ным мертиолатом,центрифугируют реакционную жидкость,насьпцают,надосадок сульфатом аммониядо 0,6, центрифугируют для полученияосадка, обессоливают растворенный в0,005 М трис НС 1 буфере рН 7,6-7,7осадок при соотношении буфер осадок1;1 на колонке с акрилексом Рихроматографируют обессоленнйй препарат на колонке с биогелем АА, элюируя при этом Фермент 0,005 М трис-НС 1-буфером рН 7,6,1573025 Таблица 1 Концентра ЭФфект очистки, раз, в зависимости от времени воздействия щелочи,ция ЫаОН,ч 1 5 10 15 16 17 18 19 20 24 57 68 70 76 57 83 82 84 75 80 92 92 76 78 91 96 78 82 97 100 87 91 93 97 75 81 91 95 78 73 70 65 Таблица 2 Жизнеспособность холерных вибрионов Концентрацият.ертиолата,% П р и м е ч а н и е. "+" - вибрионы жизнеспособны;1 1вибрионы убиты. Таблица 3Центробежное Образование осадка клеток при времени, мин 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 М + + +10Таблица 4 1573025 Эффективность очистки, раз, при времени, ч 2 3 4 5 6 7 9 12 16 18 Процент насыщения сульфатом аммония 1 20 86 96 81 87 84 85 87 86 74 81 77 78 83 84 82 83 78 79 7280 .76 Таблица 5 Наличие белкового осадка при, мин Центробежноеускорение8 10 15 20 30 П р и м е ч а н и е . "- " - осадок не отделяется,"+" - осадок рыхлый, возможны потери белка при отделении,"+" - плотный отделившийся осадок. Та блица 6 Степень очистки, раз, в зависимости от рН трис-НС 1 буфераМолярность трис-НС 1 буФера 7 ФО 7 юЗ 7 ф 5 716 1я,о 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 61 68 78 98 65 72 83 99 78 86 .98 104 80 82 90 98 81 82 88 97 98100100 96 97 98100102 98 98 Таблица 7 Общееколичество белка, мг бъем ферментсодащего препаратамл бща онцентрацияелка,мг/мл Активностамилазыед/мл тер активностьед/мл(7) ка,7 27201573025 Таблица 8 Эффект разделения Число опытов Нет Есть Таблица 9 Белок мг/мл М + и Исследуемый материал Степень очистки Надосадок культуральной жидкости после отделения Фрагментов клеток вибрионов 0,32+0,08 12,8+1,4 4,1+0,5 Обессоленный ферментсодержаЩий препарат после элюции каКолонке с биогелем Р5,3+0,23 92+0,6 1,740,/ Склон первого пика на колонке с биогелем АМ 104,2 0,23+0,09 7,7+0,6 33,59+1,2 Таблица 10 Активность фермента в единицах на 1 мг белка при сроке хранения, мес Условия хранения 1 2 3 4 5 6 Комнатная температура(20-25 С)Холодильник (+4 С) 33,6 264 20,8 16,2 8,033,6 33,4 33,3 33,3 30,2 28,4 Ю Ю Ю И И иО М И И гПОмлСоставитель А. СеменовРедактор Н. Бобкова Техред М,Ходанич Корректор Л,Патай Тираж аказ 1621ВНИИПИ Госу Подписноепо изобретениям и открытиям-35, Раушская наб., д. 4/5 ГКНТ ССС рственного комитет 113035, Москва,Производственно-издательский комбинат "Патент", г.,Ужгород, ул. Гагарина, 101 3 3 3 3 3 30 А - 0,5 МА - 1,5 МА - 5 МАМАМА - 150 М Активность, усл.ед. М + п 1 11 11 11 Удельнаяактивность,ед/мг бел.М + п
СмотретьЗаявка
4444180, 12.05.1988
ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ "МИКРОБ"
ЕЛИСЕЕВ ЮРИЙ ЮРЬЕВИЧ, МАЙОРОВ НИКОЛАЙ ВИКТОРОВИЧ, АДАМОВ АЛЕКСЕЙ КОНСТАНТИНОВИЧ
МПК / Метки
МПК: C12N 9/28
Метки: амилазы
Опубликовано: 23.06.1990
Код ссылки
<a href="https://patents.su/6-1573025-sposob-polucheniya-amilazy.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения -амилазы</a>
Предыдущий патент: Питательная среда для выращивания гриба oospora lастis источника белково-витаминной биомассы
Следующий патент: Рекомбинантная плазмидная днк pbg м3, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции с bi
Случайный патент: Гидросистема навески трактора