Способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои

СОЮЗ СОЕЕтСНИХ.социал истичеснихРЕСПУБЛИК 4242 А 9) (И) 1)4 С 12 Ю 1/2 НИЯ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУИзобретение отоэяйственной мик сится к сельскообиологии и можетдля первичного оттаммов клубенькобыть использован бора эффективнык вых бактерий сои ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ О изОБРечениям и ОчнРытПРИ ПЛАНТ СССР(53) 631;816.211:576.8 (088,8) (56) Интенсификация возделывания сои на Дальнем Востоке. Новосибирск, 1984, с. 17-26.Сэги И. Методы почвенной микробиологии. М.; Колос, 1983, с. 296. (54) СПОСОБ ПЕРВИЧНОГО ОТБОРА ЭФФЕКТИВНЫХ ШТАММОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Целью изобретения является повышение достоверности первичПель изобретения - повышение достоверности первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои.Способ заключается в инокуляции стерильных семян сои исследуемыми штаммами бактерий РМгоЪцш, выращивание растений на 1 этапе в стерильных для корневой системы условиях в течение 15-20 сут до появления клубеньков на корнях растений, переного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Способ заключается.в инокуляции стерильных семянсои исследуемыми штаммами бактерийКМгоЪыш, выращивании растений встерильных для корневой системы условиях в течение. 15-20 сут до появления клубеньков, затем пересадкерастений в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивании в течение 30-40 сут, определений сухой массы надземной частирастений и отборе эффективных штаммов по наибольшей прибавке сухой массы растений. Способ позволяет посравнению с известными лабораторными, вегетационными и полевыми способами повысить достоверность первичного отбора эффективных штаммовклубеньковых бактерий для последующей селекционной работы с ними и приэтом снизить трудозатраты, 6 табл. садке на 2 этапе растений в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивание в течение 30-40 сут, определение сухой массы надземной части растений и отборе эффективных штаммов бактерий по наибольшей прибавке сухой массы растенийП р и м е р. В пробирку диаметром 21 мм и высотой 200 мм помещают полоску фильтровальной бумаги (ширина 200, высота 150 мм), сложенную гармошкой и затем свернутую в рулон. Для поддержания влажности вокруг семян в верхней части рулона делают углубление. Впробирку.вносят 20-30 млпитательной среды для растений следующего состава, г/л: К,НРО 4 1,0; МАМБО 1,0, СаБОд 0,5, РеБО, НВО МпБО, и соль молибдена следы.Пробирку закрывают и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин. В подготовленную пробирку с фильтровальной бумагой высаживают по одному стерильному семени сои и вносят 1 мл суспензии клубеньковых бактерий сои с содержанием 1 млн. клеток/мл. В контрольные пробирки вносят 1 мл стерильной воды, Пробирки, закрытые ватными пробками, термостатируют в течение 3-5 сут при 25-27 С до прорастания семян сои. Затем их выставляют на стеллажи с дополнительным освещением. Для затенения корневой системы растений на пробирки одевают колпачки из плотной бумаги или темной пленки. В день выхода семядолей ,из пробирки ватные пробки снимают, а вокруг стебля укладывают фильтр из ваты. По мере необходимости соблюдая стерильность, в каждую пробирку дополнительно вносят по 10-20 мл питательного раствора. Растение сои в пробирках со стерильной корневой, системой выращивают в течение 15- 30 сут. Выявлено, что для образования клубеньков на корнях за счет искусственной инок 1 ляции достаточно выращивания растений сои в пробирках в течение 15-20 сут. К .этому времени на корнях сои насчитывают в среднем 7-11 клубеньков в расчете на одно растение Более короткий промежуток времени выращивания растений в пробирках (менее 15 сут) не в полной мере обеспечивает образование клу-беньков на корнях сои. Достоверность данных проверяют по отсутствию клубеньков на корнях неинокулированных растений сои. На каждом варианте выращивают не менее 15 растений сои. На втором этапе способа 15-20-суточные растения сои с клубеньками на корнях извлекают из пробирки и сразу же пересаживают в почву с природной популяцией специфичных клубеньковых бактерий. Пересаженные в почву предварительно инфицированные растения сои некоторое время устойчивы к вторичному заражению клубеньковыми бактериями, обитающими в почве. Этого времени достаточно для проявления 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 эффективности исследуемых штаммов клубеньковых бактерий сои.После высадки растений сои в почву проводят первичный полив. В течение 30-50 сут растения сои выращивают в почве с естественными (поле) или искусственными (теплица) условиями. По приросту сухого вещества надземной массы сои определяют эффективность испытываемых штаммов клубеньковых бактерий./ В опыте были изучены штаммы клубеньковых бактерий сои КЬыоЬжш 1 аропдсцш, 648 а, 639 а, ТС"37, ТД, АС(табл.1.) .Испытание указанных штаммов сои лабораторно-полевым способом показало их существенно разную эффективность в повышении массы сухого вещества надземной части растений. Так, штаммы 648 а и 639 а дают прирост сухого вещества надземной массы сои в 2,1-2,5 раза и более эффективны в сравнении с известным штаммом 646,Определение длительности лабораторного и полевого этапа выращивания сои в способе.При отработке способа установлено появление клубеньков на корнях сои на.первом этапе на 12-15 сут после посева инокулированных семян в пробирки.Однако некоторые штаммы клубеньковых бактерий через указанный выше период времени вызывали образование клубеньков на корнях сои только у 78-957 растений. При увеличении первого периода до 20 сут клубеньки на корнях сои отмечают практически у всех растений. Поэтому первый этап способа ограничивают 15-20 сут выращивания сой в стерильных пробирках.Оптимальная продолжительность выращивания пересаженных в почву растений сои (второй этап способа) составляет 30-40 сут (табл.2). При увеличении продолжительности выра; щивания растений сои на втором этапе способа заметно снижается эффективность искусственной инокуляции. Более короткая продолжительность выращивания растений сои не обеспечивает оптимального проявления эффективности испытываемых штаммов клубеньковых бактерий.Сравнительная оценка способов первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои.Первичный отбор эффективных штаммов бактерий сои К.1 аропсцш проводят известным лабораторным и лабораторно-полевыми способами.Описание постановки опыта согласно лабораторно-полевому способу описано выше, при этом используют сорт сои ВНИИС.Известный лабораторный способ пер вичного отбора штаммов бактерий сои, заключается в выращивании инокулированных растений в сосудах емкостью 1 л на стерильной агаризованной среде, песчаной культуре или почве.Агаризованная среда представляет собой раствор Прянишникова с 0,1 нор мой азота и добавлением 2% агар-агара. Этот же раствор, но без агарагара используют для песчаной культуры. Приготовленные сосуды с субстратами стерилизуют при 2 атм в течение 30 мин. В сосудах с песком и почвой поддерживают влажность на уровне 703 от полной влагоемкости. Семена сои инокулируют из расчета 1 млн. бактериальных клеток на 1 семя. Используют сорт сои ВНИИС. В каждом сосуде оставляют по 4 растения, которые выращивают 30-40 сут. Дальнейшее выращивание растений сои ограничивают возможностями емкости сосудов, а также высокой агрессивности природных РМхоЬцш 1 аропхсцш. Использование много- литровых сосудов резко снижает обьем испытываемых штаммов, что недопустимо при первичном отборе.В лабораторно-полевом способе первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои также использовался сорт ВНИИС, Семена инокулировались из расчета 1 млн./мл клеток на одно семя.Предлагаемый способ состоит из двух этапов - лабораторного и полевого. В условиях лаборатории бактеризованные растения сои выращивали в пробирках на фильтровальной бумаге до фазы образования клубеньков в течение 15-20 сут. За счет выращивания растений сои со стерильной корневой системой в пробирках удается резко увеличить количество испытываемых штаммов.Сравнивая известный (лабораторный) и лабораторно-полевой способы первичного отбора (табл.З), отмечают значительные преимущества последнего. 20 25 30 35 40 45 50 55 В анализируемых способах испытывают примерно одинаковое количество штаммов клубеньковых бактерий сои с различной эффективностью. В качестве стандарта-эталона используют известный эффективньп штамм 646.При использовании известного лабораторного способа с тремя видами субстрата только в песчаной культуре удается отобрать минимальное количество штаммов клубеньковых бактерий сои для последующих испытаний в полевых опытах, В сосудах, где используют в качестве субстрата агар-агар и почву, искусственная инокуляция семян сои не оказывает положительного влияния на продуктивность растений. В среднем из 45 испытываемых штаммов известным способом только 2 Х повьппают продуктивность растений сои на 257 в сравнении с контролем.В то же время при испытании этих же штаммов лабораторно-полевым способом 613 бактериальных культур повышают продуктивность растений сои более чем на 253 табл,З).Способ позволяет выявить штаммы, вызывающие .повьппение продуктивности растений сои в 2-2,5 раза по сравнению с контролем. Это дает возможность вести первичный отбор наиболее эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои для последующего окончательного их:испытания, в полевых опытах (табл.4) .Такие данные приведены в табл.4 по сравнительному анализу эффективности штаммов лабораторно-полевым и, известным способом проведения первичного отбора.Известный штамм 646 не эффективный при испытании его известным лабораторным способом с субстратами агар-агар, песок, почва. Использование нового способа эффективности этого штамма подтверждается.Штаммы 648 а, 639 а, ТС, ТД, АС, испытываемые известным способом, являются слабо эффективными или не эффективными, При испытании их лабораторно-полевым способом эти штаммы показывают высокую эффективность. Так, штаммы 648 а и 639 а увеличивают прирост сухого вещества надземной массы сои в 2, 1-2,5 раза. Сравнивая результаты, полученныелабораторным и лабораторно-полевым1482942 Таблица 1 Масса надземнойчасти сои, % кконтролю Штаммы 646 (известныйштамм)648 а639 аТС ТД АС178 257 219 145 109 148 Т а блица 2 Продолжительность второгоэтапа, сут. Количество испыИэ них повышающие прирост надземной массы сои, % к общемуспособами первичного отбора перспективных штаммов, установлены значительные преимущества последнего. Способ позволяет резко поднять ре 5 эультативность и достоверность первичного отбора новых штаммов клубеньковых бактерий сои, он менее трудоемок, дает возможность вести отбор " штаммов не только в летний (поле), но и зимний (теплица) периоды, что ускоряет селекционный процесс.В табл.5 показаны результаты вегетационного опыта по оценке эффективности штаммов риэобий сои. 15 В сравнении с лабораторно-полевым способом, в котором для этих штаммов установлены существенные различия в эффективности различных штаммов от +9 до +257%, в вегетационном опы те по приросту фитомассы эффективность штаммов значительно более - близкая (от -13 до+11% разница по отношению к контролю). По признаку зерновой продуктивности изменения по 25 сравнению с контролем составляют -2 до +8%. Трудозатраты при проведении вегетационного опыта (40 сосудов Вагнера) 30 составляют (без закладки и учета урожая) 96 человекодней, тогда как при лабораторно-полевом способе (40- вариантный опыт) 24 человекодня на весь объем работ,35При выявлении эффективности штаммов ризобий в полевом опыте ( 10-ти вариантная схема, общая площадь делянки 50 м) общие затраты достигают 120 человекодней при учете зерновой 40 продуктивности и 60-70 человекодней при учете показателя прироста и достоверность полученных данных по сравнению с лабораторно-полевым опытом также значительно ниже (табл,6). 45 Таким образом, лабораторно-полевой способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои позволяет в сравнении с известными способами повысить объективность отбора и снизить трудозатраты. формула иэ обретения Способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои, включающий инокуляцию стерильных семян растений исследуемыми штаммами бактерий рада КЬыоЪшш, выращивание растений в стерильных для корневой системы условиях, определение массы сухого вещества надземной части растений с последующим отбором штаммов бактерий по наибольшей прибавке сухой массы растений, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения достоверности способа, выращивание инокулированных рас-тений в стерильных условиях осуществляют в течение 15-20 сут, затем растения пересаживают в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивают 30-40 сут.10 1482942 Таблица 3Л Способ Субстрат Количество испыИз них повышающие приростнадземной массы сои, % кобщему тываемыхштаммов Всего В том числе с прибавкой.Лабораторный АгарПесокПочваВсегоПочва в Лабораторнополевой 19 58 63 теплице Почва в 63 61 63 63 О 2 30 49 полеВсего Таблица 41 Известный способ (лабораторный) Штаммы Способлабораторнополевой 1 1 Агар Песок Почва 646 (стандарт)648 а639 аТС ТД АС105 166 83 Таблица 3 Масса сухого вещества растений, г/сосудБобы Семенаг % к кон- тролю Штаммы Всего растения СоломаР 2,33 ц/га (13%) х 0,81 ц (4,5% Тираж 500 Подписноею фвпо изобретениям и открытиям при ГКНТ СССРЖ, Раушская наб., д. 4/5