Способ определения пептидов в напитках

(51)4 1 Н 331 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЬСТВ А ВТОРСНОМ ел ьщ Ьеп(54) СПОСОБ ОП В НАПИТКАХ (57) Изобретен ЕДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ е относится ксти. Способ соализа и расходв и материалов евои промышленн ращаетхимилительностьеских реакти аза, Согтакже повышает ласно способу очность анал следуемого н ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ(56) РегегяЬагег С, Ргеу Ч, Е 1 перЬогошеггдясЬе Мегпо 4 е гиг апа 1 уясЬеп, Веягпппшщ акоп Рергдйеп пеАпппояап гео. - АцсгосЬппса Асса1969) М 5, я.981-988.Авторское свидетельство СССРУ 630582, кл, С 01 М 33/14, 1978 питка, доведенного до нейтральной среды (рН 7), пропускают через стеклянную колонку размером (1,0 х х 20 см), заполненную ионообменной смолой КРСП в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин, После промывания смолы дистиллированной водой в количестве 15 мп проводят элюирова" ние пептидов 30 мл 10-ного раствора аммиака со скоростью 2,0 мл/мин. 4,0 мй полученного элюата, имеющего рН среды 12,5, наливают в мерную колбу емкостью 25 мл, добавляют 0,5 мл 0,1 н. раствора метилглиоксаля, смесь выдерживают 30 мин при комнатной тем"о пературе (18-20 С), приливают 1 н, р раствор соляной кислоты с таким рас" четом, чтобы рН среды стала равной 3,0-3,2. В колбу добавляют дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают, после чего проводят слектрофотометрирование продуктов реакции при 335 нм, Содержание пепти" ффффф дов определяют по калибровочной кри" С 4 вой. 1 ил., 2 табл. ФФ)(2) 113 бб 94Изобретение относится к пищевойпромышленности, в частности к способам определения пептидов в напитках,и может применяться в консервной, пи 5вобезалкогольной, винодельческой промышленности,Целью изобретения является повышение точности анализа, сокращение егодлительности и снижение расходовреактивов и материалов.Способ осуществляют следующим .образом,10-20 мл напитка наливают в химический стакан емкостью 50 мл, добавляют щелочь до получения рН среды 7,0 (0,5-1,2 мл 1 н, щелочи) ипропускают через стеклянную колонку(размером 1,Ох 20 см), заполненнуюионообменной смолой КРСП в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин.Ионообменная смола КРСП - продуктсополимеризации стирола и дивинилбензола (ДВБ) - характеризуется низкимпроцентом сшитости (2 А ДВБ), Пептиды 25задерживаются на смоле вследствиеионообмеиа и сил адсорбции. Большинство веществ, искажающих результатанализа (белки, фенольные соединения,соли, сахара, органические кислоты),свободно проходят через колонку, илишь незначительная часть примесейзадерживается на смоле, Для гарантированного смыва этой части примесейсмолу промывают дистиллированной водой в объеме, равном объему исходной35пробы (10-20 мл) . После промываниясмолы проводят элюирование пептидов103-ным раствором аммиака со скогсстью 2,0 мл/мин. 10%-ный раствораммиака, имеющий рН среды 12,5(элюент), берется в двухкратном избытке по отношению к объему исходной пробы для обеспечения полнойэлюации пептидов из смолы, Так какколичество пептидов и аминокислот вполученном элюате весьма незначительно по сравнению с объемом элюента,то рН среды последнего практическине изменяется и остается равным 12,5,Для проверки полноты элюирования пептидов и аминокислот со смолой 1,О 2,0 мл элюата наливают в мерную колбу емкостью 25 мл и добавляют 0,5 мл0,1 нраствора метилглиоксаля, Такого55количества раствора метилглиоксаляс избытком достаточно для полноговзаимодействия с содержащимися вэлюате пептидами, в результате чегп 3 2образуется продукт имеющий максимум поглощения при Л =335 нм, Смесьвыдерживают 30 мин при комнатнойтемпературе (18-20 С), Затем в колбу приливают 1 н, раствор солянойкислоты до получения рН среды 3,03,2. В колбу добавляют дистиллированную воду до метки 25 мл и тщательноперемешивают. Полученный растворналивают в кювету слоем толщиной1 см, после чего измеряют оптическуюплотность при 3 =335 нм. Если оптическая плотность 0 ) 1,2 и зависимость0 = Й (С) выходит за пределы линей"ного участка калибровочной кривой(см. чертеж), то исследуемая пробачрезмерно концентрирована, анализпосле ее соответствующего разбавления повторяют, По калибровочной кривой (фиг. 1) при оптической плотности0 находят концентрацию пептидов С(мМоль/л). Полученные данные С пересчитывают по формуле где ш - концентрация пептидов вмг/л;К - коэффициент разбавления; С - концентрация пептидов,мМоль/л,М г - молекулярная масса трипептида глицил-глицил-глицин, равная 189 г/моль.Для сравнения результатов анализа с аналогами концентрацию пептидов выражают в мг азота пептида на литр (мг Б пеп/л) по зависимости: где ш- концентрация пептидов,мг М пеп/л;М- молекулярная масса азота,равная 14;и - число атомов азота входящих в состав пептида (дляглицил-глицил-глицина и=З).Общая продолжительность анализасоставляет б 5 мин,П р и м е р 1, 15 мл яблочногосока наливают в.химический стакан емкостью 50 мл, добавляют едкий натрий до получения рН среды 7,0(1,2 мл 1 н. НаОН) и пропускают через стеклянную колонку (размером1,0 х 20 см), заполненную ионообменной смолой КРСП в водородной форме,со скоростью 1,5 мл/мин. Далее про434следуемого напитка по прототипу дал следующие результаты: 305 и 68 мг/л соответственно, Продолжительность анализа по прототипу 95 минП р и м е р 310 мл пива наливают в химический стакан емкостью 20 мл, добавляют едкий натрий до получения рН среды 7,0 (0,5 мл 1 н. МаОН) и пропускают,через колонку (размером 1,0 х 20 см), заполненную ионообменной смолой КРСП в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин. Далее промывают смолу Дистиллированной водой в количестве 1 О мп, После этого проводят элюирование пепти"ф дов 20 мл 10 Е-ного аммиака со скоростью 2,0 мл/мин 1,0 мл элюата, имеющего рН среды 12,5, используют для проведения реакции с метилглиоксалем, после чего подвергают спектрофотометрическому анализу, как описано в примере 1, При оптической плотности П = 0,870 концентрация пептидов равна 1658 мг/л, азот пептидов - 365 мг/лОбщая продолжительность определения 65 мин, При проведении анализа напитка по прототипу концентрация пептидов составила 1531 мг/л, а азот пептидов - 340 мг/л. Общая продолжительность анализа по прототипу - 88 мин.П р и м е р 4. Сравнительный анализ точности двух методов определения пептидов проводят на яблочном соке и столовом вине. Предвари тельно в каждом из исследуемых напитков определяют концентрацию пептидов. Из химически чистого препарата глицил-глицил-глицина готовят рабочий раствор с концентрацией 2000 мг/л, Рабочий раствор пептида добавляют в каждый из напитков из расчета 100 мг/л. В последующем проводят определение суммарного содержания пептидов так, как описано в прототипе и приведенных выще примерах. Критерием оценки точности методов служит процент определения добавленного пептида. 50 13669 мывают смолу дистиллированной водой в количестве 15 мл. После этого проводят элюирование пептидов 30 мл 107-ного раствора аммиака (2-кратное разбавление) со скоростью.2,0 мл/мин.5 Полученный элюат имеет рН среды 12,5. В мерную колбу емкостью 25 мл наливают 2,0 мл элюата, добавляют 0,5 мл 0,1 н. раствора метилглиоксаля, смесь,о выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20 С). Затем в колбу приливают 1 н. раствор соляной кислоты до получения рН среды 3,0-3,2. В колбу добавляют дистиллированную воду до метки 25 мл (12,5-кратное разбавление) и тщательно перемеши" вают. Полученный раствор наливают в кювету слоем толщиной 1 см, после чего на спектрофотометре СФА изме 20 ряют оптическую плотность при 3 =335 нм. По калибровочной кривой при оптической плотности 0 = 0,850 концентрация пептидов С равнамМоль 25 0,172 в - в ; так как коэффициент разбавления К = 25, то щ = 812 мг/л (по формуле 1), а азот пепетидов щ,= 178 мг/л (по формуле 2). Общая продолжительность анализа 75 мин. ЗОПараллельно проводят анализ исследуемого напитка по способу-прототипу, концентрация пептидов состав" ляет 736 мг/л, а азот пептидов 164 мг/л, Продолжительность анализа по прототипу - 102 мин.35П р и м е р 2. 20 мл вина наливают в химический стакан емкостью 50 мл, . добавляют едкий натрий до получения рН среды 7,0 (,2 мл 1 н. ИаОН) и40 пропускают через стеклянную колонку (размером 1,0 х 2 0 см), заполнен" ную ионообменной смолой КРСП в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин. Далее промывают смолу45 дистиллированной водой в количестве 20 мл, После этого проводят элюирование пептидов 40 мл 10%-ного раство- ра аМмиака со скоростью 2,0 мл/мин2,0 мл злюата имеющего рН среды 12,5, используют для проведения ре,акции с метилглиоксалем, после чего 1подвергают спектрофотометрическому анализу, как описано в примере 1. По калибровочной кривой при оптической плотности 0 = 0,360 находят кон 55 центрацию пептидов - 349 г/л, азот пептидов - 7 мг/л, Общая продолжительность анализа 80 мин. Анализ исРезультать определения и математической обработки приведены в табл, 1, из которой следует, что более высокая точность достигается по предлагаемому способу (Е определения пептидов по предлагаемому способу составил 99,2 и 98,8, а в прототипе - 97,4 и 91,7 соответственно).5 1366943еТехнико-экономическая эффектив- о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,ность предлагаемого способа дости- с целью повыщения точности анализа,гается сокращением продолжительно- сокращения его длительности и сни"сти анализа и расхода химических ре-. жения расхода реактивов и материаактивов и материалов (табл. 2).5лов, щелочь вводят в пробу до.обеспечения рН 7,0, после чего выделяютФ о р м у л а и э о б р е т е н и я пептиды из пробы путем пропусканияСпособ определения пептидов в ее через ионообменную смолу КРСП внапитках, предусматривающий отбор 0 водородной форме, промывают смолупробы, введение в нее щелочи, доведе- дистиллированной водой и элюируютние рН раствора до 12,5, внесение пептиды, при этом доведение рНметилглиоксаля, выдержку, спектрофо- раствора до 2,5 осуществляют в протометрирование продуктов реакции и цессе элюирования пептидов 103-ным ., установление концентрации пептидов, 1 раствором аммиака.Таблица 1 Способ-прототип Предлагаемый способ Напито Исходное 7 опре делени пептид Найдено глиДобав"лено Исходное соДобавлено Най" опре- ления деноглицилглицилглицидержание пе глицилглицилглициилсодержаниепепти" глицилглицил глициа гл о лицинамг/л г л на, мг/л г/ Яблочныйсок 7,4 81 00 00 909 99,01 18 80 Столововино 05 367 91, 7 9 00 8,8 370 37 3741366943 Таблица 2 Способ прототип предлага- емый 73 95 за, мин Стоимость расходуемых реактивов и матерна"лов коп 3,312 5,994 0,246 0,018 Соляная кислота 0,010 0,040 Аммиак 2,880 1,600 1,200 Пиво Наименованиепоказателей Продолжительность анали" В том числе; Ацетат свинца Гидроксид натрия Метилглиоксаль Смола КРС"2 П Столовое вино Яблочный сок 0,010 0,010 0,040 0,600 0,012 1,440 0,600 0,6001 Составитель Л. ПашининРедактор А. Маковская Техред М,Дидык рректор А. Обруч 3 писное Ужгород, ул, Проектная оиэводственно-полиграфическое предприятие з 6834/44 ВНИИПИ Государст по делам изоб 113035, Москва, Ж