Способ получения водорастворимых комплексов ферментов класса оксидоредуктаз

ОП ИСАЙИ Е Своз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл.2 С 07 6 7/02 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий, ПриоритетОпубликоваиб 15.05,79. Бюллетень Ио 18(у) 3 аявитЕЛ Московский ордена Ленина я ордена Трудового Красного знамени государственный университет им. М, В . Ломоносова Г(54) СПОСОБ "ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХКОМПЛЕКСОВФЕРМЕНТОВ КЛАССА ОКСИДОРЙДУКТАЗ Известен способ получения иммобилизованных ферментов, когда в ка честве водонерастворимого носителя используют сополимеры диметилацеталя М-акриламиноацетальдегида и Я,Ыф-метиленбисакриламида 2). Изобретение относится к способу получения иммобилизованных фермен- тов, а именно к способу получения иммобилизованных на водооастворимых полимерах ферментов класса оксидоредуктаз, которье могут бь:ть , использованы в проточных реакторах мембранного и колоносного типа, атакже в автоматических анализаторахбиологических объектов. Стабйльные ферментные препараты, иммобилизованные такиМ способом могут найти йри- менение в медицинской и пищевой про, мышлейности, в тонком органическом синтезе, при создании преобраэова-. 15 телей химйсеской .энергии в электрическую, а также в охране окружающей среды,/Известно, что иммобилизация ферментов на различных твердых носителях, а также образование комплексов с водорастворимыми полимерами позволяет увеличить продолжительность действия ферментов,и обеспечивает их технологичность (1). Особые трудности при иммобилизации встречаются ,:в работе с оксидоредуктазами (например оксидазами метанола, глюкозы, ,различными видами дегидрогеназ). " Нестабильность этих ферментов в иммо-ЗО 2билизованном состоянии затрудняет разработку способов их использования в различных областях народногО хозяйства;В настоящее время одним из основных способов получения иммобилизованных ферментов, в частности оксидоредуктаз, является их пришивка к носйтелям"содержащим свободные альдегидные группы. При этом происходит образование ковалентной связи между свободными аминогрупйами фермента или его сульфгидрильными.группами и альдегиднымигруппами носителя. Важнейшей характеристикой приготовленных таким способом ферментов является величина остаточной актйвности и стабильность. Как правило, происходит значительное падение активности, а стабильность иммобилизованных ферментов повышается, Абсолютные значения этих величин зависят от вида исполь- зуемых носителей и ферментов.662557 3Недостатком указанного. способа является значительная потеря актйвности ферментов при иммобилизации.Так, в случае трипсина сохраняет 25начальной активности, а при иммобилизации Ф -амилазы эта величйна составляет всего лишь 1-4. 5 Из других полимеров, содержаших свободные альдегидные группы, следует отметить сополимеры стирола и акрилового альдегида (3, а также р сополимеры винилиновых эфиров акриловой кислоты - вакрил икованакрил (4).Недостатком укаэанных методов является большая потеря активности фермента при его иммобилизации, достигающая в некоторых случаях 90, й более. Кроме того, стабильность фермента часто лишь незначительновозрастает при такого родаиммобилизации. 20Известен также способ полученияводорастворимых комплексов Ферментов. классаоксидоредуктаз, в частности глюкозооксидазы, заключающийся в обработке раствора фермента 25 растворами водорастворимых полимеров,: поливинилпирролидона, полиэтилейоксида, сополимера винилпирролидона и вйнйлацетата (5). Полученные таким образом комплексы фермента с полимером сохраняют высокуюначальйуюактивность (до 90), однако стабильность их лишь в 2-3 разапревышаетстабильность нативных ферментов, Кроме того, отсутствие ковалентнйх-связей между молекуламиФермейта и-полимером делает обра.зовавшиеся комплексы непрочными и .не"йоэволяет эффективно исйольэоватьжх в технологических процессах. 40. ЦеЛью описываемого способа является йовышение стабильности ферментовс одновременным сохранением высокогоуровня Ферментативной активности.указанвая ц,ль достигается за счет - 45 . того, что в качестве водораствори- мой полимерной подложки для иммобилизации Ферментов класса оксидоредук-:таз используют кватернизованные синтетические водорастворимые полимеры 50на основе 4-винилпиридина и акролеина, содержащие альдегидные группы,Тособные взаимодействовать с сульфг дрильными и аминогруппами ферментов с образованием прочного ковалентного комплекса фермента с полимером.Согласно изобретению описываетсяспособ получения водорастворимогокомплекса ферментов класса оксидоредуктаз с повьваенной стабильноСтью.и 60высокими, качествами в смысле технологичности использования полученныхпрепаратов путем обработки ферментов водорастворимым кватернизованнымсополимером акролеина с 4-винилпиридином, содержащим альдегидные группы. Процесс получения иммобилиэованных описываемым способом препаратов является двухстадийным и его проводят предпочтительно следующим образом.1. Получают вдорастворимый полимер, являющийся сополимером акролеина и 4-винилпиридина. Эти сополимеры могут содержать 5-. 30 акролеиновых звеньев. Для придания этим полимерам растворимости в воде их кватернизуют любый алкилиРующйм агентом, например диметилсульфатом. Степень кватерниэации можно варьировать от 20 до 95 пиридиновых звеньев.2, К раствору Фермента с рН 4-10, преимущественно 7-8, добавляют раствор кватернизованного сополимера акролеина с .4-винилпиридином. Весовое соотношение полимера и Фермента в растворе можно варьировать от 1:1 до 30:1, при этом лучше использовать раствор, содержащий кофакторы или субстраты Фермента, Добавление полимера приводит к образованию прочного ковалентного комплекса с ферментом, сохраняющего .высокую каталитичзскую активность и обладающего повышенной стабильностью. Данный .способ йозволяет с большой простотой получатьводорастворимые стабилизированные ферменты, которые могут быть с успехом использованы в проточных реакторах мембранного типа.Преимущество полимер- ферментнйх комплексов такого типа заключаетсяв том, что благодаря присутствиюсвободная альдегидных групп в полимерной цепи; не вступивших в реакцию:с Ферментом, комплексы могутбыть легко иммобилизованы на различного типа макропористцх твердых подложках, содержащих свободные аминогруппы (например аминосиланиэированныекремйезеьа). Кроме того, наличиекватернизованйых йиридйновых колец,несуцих положительный заряд, позволяет проводить адсорбционную иммобилизацию полиферментных комплексов на твердых носителях, имеющих отрицательный заряд (например пористые стекла), Специфический эФфект стаби- лизацииактивности Ферментов, содержащих сульфгидрильные группы, сополимером акролеина с 4-винилпиридином может быть обусловлен также способностью пиридиновых колец связывать в растворе ионы металлов, каталкзкрующих необходимое окисление сульф-: гидрильнйх групп.П р и м е р 1. 10 г 4-винилпиридийа растворяют в 50 мл диметилформамида, содержащего 10 мг азобясиэобутиронитрила в качестве инициатора полимеризации и добавляют 1 .мл свежеперегнанного акролеина. Раствор заливают в ампулу и откачивают воздух.Чапаянную ампулу помещают в термостат (60 фС) и выцерживают 5-6 ч.Полимер осаждают диэтиловым эфиром,662557 5 6 Выход продукта 7 г, Содержание акро- мент = 1:1). Смесь выдерживают при . леиновых звеньев, определенное окси- комнатной температуре 30 мин. Остамйнированием и по Ж-спектрам (при точная активность фермента после обдлине волны Л - 1715 см 1, соответст- разования комплекса"95. Исследо- вующей валентным колебаниям С - 0 вана с;абильность полученного комгруппы), составляет 20плекса в присутствии 0,3 М формиата5 г полученного сополимера раст натрия при 37 С. Нативный фермент воряют в 10 мл этанола и добавляют в присутствии О,З М Формиата пол г диметилсульфта, Реакцию проводят ностью теряет активностьчерез 500 чР при комнатной температуре в течение а комплекс сохраняет 50 активности 1 сут, Продукт осаждают диэтиловым через 800 ч и около 20 через 12000 ч. эфиром, Содержание кватернизованных О П Р и м е р 4, К 3 мл раствора пиридиновых колец определяется по . глюкозооксидазы (кф 1,1.3.4) кон- ПМР-спектру или по ИК-спектру (ис- центрации 1,710 М, содержащего польЗуется соотношение интенсивнос- )1 М КСРН 8,0 добавляютти полос при длинах волн Л -1600 см- Раствор сополимера акролеина с 4-випиридийовое кольцо и д - 1640 см 1 - )5 нилпиридином (20 альдегидных групп, кватерниэованное кольцс(, й состав алкилирования, - Мол. вес около ляет 50 . 45000) концентрацией 4 10м, СмесьП р и м е р 2. К 2 мл раствора выдерживают при комнатной температуформиатдегидрогеназы(КФ 1. 2. 1. 2) ре в течение 30 мин. Остаточная ак(мол. вес. 96000) с удельной актив- тивность фермента после образования ностью 5 ед/мг и концентрацией .комплекса 100. Исследована термо 200,310 М в фосфатном буфере с РЯ стабильность глюкоэооксидазы в раст,0, содержащем НАД+ в концентрации воре при температуре 60 фС и РН 5,6. 10 мг/мл, приливают 2 мл раствораИз раствора отбирают пробы по 50 мкл сополимера акролеина с 4-винилпири- и добавляют к 1 мл растворами - .глюдином (20 альдегидных групп, 50 25 козы концентрации 10м в фосфаталкилирования, мол. вес 45000) кон- ном буфере РЯ. 5,8. Активность опцентрации 910М (соотношение :. . ределяот .вольтаййеРометрическимме полимер: Фермент : 30:1). Смесь: вы- тодом, измеряя убыль растворенного держивают при комнатной температуре кислорода впробе кислородным элек мин. Остаточная вктивность фер тродом Кларка притемпературе 25 фС мента после образования комплекса 90. и РЯ 5,8. Активность расчитывают по . Исследована стабильность Формиатде- . линейному участку графика зависигидрогенаэы в растворе в фосфатном мости "тангенса угла наклона изме- буФере при температуре 30 с в отсутст- нения тока от времени; Определяют вие каких-либо добавок, в присутствии 35 константы инактивации первого по жг/мл НАд + и в комплексе с поли-Рядка нативного фермента и ф .Рмента мером в присутствии 10.мг/мл яАд+:. в комплексе с полимером. Соответс Из раствора отбирают пробы цо 0,1 мл, вующие значения составляют 7 810 ми д авляют в кювету, содержащую 0,7 мл и 4 10 . мин. Таким образом, стаобф -3Ффосфатного буфера РЯ 7,5, 0,1 Мл. .,- 40 бильность фермента возрастает приблираствора НАд+ концентрации 10 мг/м эительно в 20 раз.и .0,1 мл 3 М раствора формиата иизмеряют скорость реакции окисления4 ормула изобретенияФормиата, за которой следят спектрофотометрически по образованию вос 1 Способ полУчения войораствори Финовленйой формы НАД Н 2 при длинемых комплексов Ферментов класса ок-.45волны 340 нм. Определенй константы сидоредуктаз путем -обработки Ферменинактивации нативного фермента в -. тов водорастворявыми полймерами, присутствии 10 мг/мл НАД+ и ком о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с плекса фермента с полимером в прй- целью повышения стабильности Ферменсутствин 10 мг/мл ЯАд + при 30 ос 50 тов с одновременным сохранением высо- Соответствующие значения равны 3,2 10-ф кого уровня ферментативной активносмин и 3,0-10- мин- . Как видно иэ .-1 . Э ти, а также с цельМ повышения техэтого пРимера, стабильность фермента нологичности использования водорастфповЬпаается примерно в 90 раз. воримых комплексов ферментов, в ка 55 честве водорастворимых полимеров,П, р и м е Р 3 К 2 мл Раствора фор- используют содержащие альдегидныемиатдегидрогенаэыФд др генаэы (к Ф 1.2,1,2),: . группы кватернизованные сополимеры акмол. вес. 3600036000 с удельной активностью ролеина с 4-винилпиридином,15 еД/мг и концентРацией 2 10 М в . 2. С особ по п. 1, о т л и ч а юуфере р ,5, содержащем, 60 щ и й с я тем, что фермент и .полимерформиат натрия в концентрации О,б М, берут в соотношении 1:1 - 1:30 цоприливают 2 мл раствора сополимера весу.акролеина с 4-винилпиридином (20 Источники информации, принятые воальдегидных групп, 50 алкилирования, внимание при экспертизе210-Фмол. вес около 45000) концентрация, . 1. ффйммобилизованные ферментыМ (соотношение полимер: фер-под Ред И В Б ерезина В, К. Анто