Штамм вируса гепатита а для накопления биомассы, используемой для приготовления профилактических и диагностических препаратов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК А 1 агг Ш 4 С 12 Я НИЯ САНИЕ ИЗОБРЕТ АВТОРСК(21) 4294237/ (22) 05.08.87 (46) 23.04.89 (71) Институт ных энцефалит (72) Ю,Ю. КусДонец, В Бюл. У 15полиомиелитв АМН СССР ирус в, Л.И. ПаниВ. Вайткене М.С.Ба М.А. лаян 53) А А ДЛЯ НАУЕМОЙ ДЛЯСКИХ И ДИк вирусоике и ваксолотикиинйекедицин ов им. . Штамм сится к вирдля диагнки вирусныхции вируса ние отазнаофилно ин Изобрет и и пред вакциноп ф епаций, а имен тита А (ВГАЦель иэо ма ВГА, спо перевиваемо лением виру достаточных тических и тов.).бретесоби получение штамазмножению вклеток с накопв количествах,отки профилакских препаран учуюте хлоого,кьтуремассыразраостич для иаг ВГА Лза шесть д льного геп ВГАЛколлекции астандартиз сотухи фе-,ан под выделен ей до же титом депониро осударст зации и Штамм бранных калий б В 177 инсти енногоонтроля ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМпРи пгнт сссР СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) ШТАММ ВИРУСА, ГЕПАТИТКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ, ИСПОЛЬПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОФИЛАКТИЧЕАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относитслогии, а именно к диагнос цинопрофилактике гепатита А (ВГА).Цель изобретения - получение первогоотечественного штамма ВГА, способного к размножению в перевиваемой культуре клеток с накоплением вирусноймассы в количествах, достаточныхдля разработки профилактических и диагностических препаратов. Штамм ВГАЛдепонирован в коллекции ГИСКпод В 177 и характеризуется свойствами, присущими ВГА. Штамм адаптированк перевиваемой культуре клеток почекзеленой мартышки 4647, причем уровеньпродукции достаточен для разработкиинактивированной вакцины против ГАи пригоден для специфической диагностики ВГА. 1 табл. м ских биологических препарат Л.А. Тарасевича,ВГАЛхарактеризуется следующими свойствами.Частицы ВГА по данным электроннойфмикроскопии имеют,Р=27 нм. Основная масса частиц имеет плав плотность 1,34 г/см в градиенЭристого цезия и коэффициент седиментации 155-160 Б- в градиенте1нейтральной сахароэы.По данным иммуноферментного анализа (ИФА) титр антигенной активности составляет 1: 16-1:32. По данным нммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ) вирусные частицы взаимодействуют с предварительно аттестованной анти- ВГА сывороткой с образованием харак 1474171терного венчика из антител вокругчастиц. Следовательно и по известнымморфологическим физико-химическими антигенным свойствам штамм Л не отличается от естественно циркулирующего в природе ВГА, Содержащийся в 10%-ном йекальном экстрактевирус пассируют три раза в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона 10макаки резус (линия РИК), а затем три раза - в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки4647,Штамм ВГА Лпредставляетсобой взвесь заряженных вирусом клеток почек зеленой мартьппки 4647,собранных после заражения на 21 сутинкубации при 37 С. Титр инфекционной активности составляетт,10ТкИД /мл, а титр антигеннойактивности равен 1:16-1,"32, Морйологические (йорма и размер частиц икосаэдр 27 нм), Физико-химические (плавучая плотность 1,34 г/см и коэф 9Фициент седиментации 155-160 Ящщ)и серологические свойства (способность взаимодействовать с анти-ВГАантителами) штамма Лсоответствуют характеристикам циркулирующихв природе штаммов ВГА. Полученный30штамм ЛВГА при размножении вкультурах клеток РВЪКи 4647 является продуцентом вирусного антигенадля специйической диагностики гепатита А. При размножении в разрешенной 35для вакционного производства культуре клеток 4647 штамм ВГА Лиспользуют для накопления вирусной мас сы при производстве инактивированной вакцины против гепатита А, 40П р и м е р 1, Штамм ВГА Л- продуцент вирусного антигена для специфической диагностики гепатита А.Собранные за шесть дней до желтухи фекалии больной с клинически выраженным диагнозом гепатита А гомогенизирумт в 0,1 М Фосйатно-солевомбуйере рН 7,4 в гомогенизаторе ввиде 10%-ной суспензии, добавляют0 равный объем охлажденного (О С) йреона, экстрагируют в течение 10 мин и центрийугируют для расслоения Фазпри 1500 об/мин в течение 10 мин. Полученный Фекальный экстракт со 55 держит вирусные частицы размером 27-30 нм, которые взаимодействуют с предварительно аттестованной сывороти кой с образованием характерного венчика из антител (данные ИЗМ), По данным изоциклического центрийугирования в хлористом цезии основная популяция части имеет плавучую плотность 1,34 г/см . Коэййициент седизментации этих частиц равен 155- 160 Бкак следует из данных центрифугирования (35000 об/мин, 2 ч, о5 С) в градиенте плотности сахарозы (10-35%). Вирусные частицы способны взаимодействовать с анти-ВГА антителами, как следует из данных ИФА и ИЭМ. В 10%-ный фекальный экстракт добавляют по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, а также канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл и выдерживают при 37" С в течение 4 ч, полученную смесь инокулируют в течеоние 2 ч при 37 С на предварительно хорошо сйормированный монослой перевиваемых клеток почек эмбриона макаки резус (линия РЕЬК). В качестве среды роста применяют среду ИглаМЕМ с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов (ИглаМЕМ), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а в качестве среды потдержания - среду ИглаМЕМ с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Среду поддержания меняют один раз в неделю.о Через 42 дня инкубации при 37 С сливают с монослоя клеток культуральную жидкость, монослой промывают раствором Хенкса и снимают клетки в среде ИглаМЕМ без сыворотки после предварительной кратковременной обработки монослоя клеток 0,02%-ным раствором ЭДТА. Содержащийся в культуральной жидкости вирус концентрируют путем осаждения 10%-ным полиэтиленгликолем (ПЭГ) в течение 16 чопри 4 С, собранный при центрифугировании осадок (1000 об/мин, 30 мин) восстанавливают в 1/30 объема исходной культуральной жидкости, и полученный концентрат обдъединяют с лизатом заряженных клеток. Клетки разрушают путем пятикратного замораживания (-70.С) и оттаивания (+10 С), Объединенную таким образом смесь используют в качестве инокулята для следующего пассажа вируса. На уровне 4 пассажа срок рамножения (21 сут) и продукция вируса как по антигенной (титр 1:64), так и по инфекционной ( 10Тк 1 Щ А ) акФормула изобретения НомерпассаАнтигенная акСрок инкубации,сут Температура инкубации,С тивность.1521 Зо 2 353 Составитель А.ИаныкинТехред А.Кравчук,. Корректор С.йекмар Редактор Н,Гунько Заказ 1840/23 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж Раушская наб., д. 4/5 производственно-,издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,301 5 14 тивности близки аналогичным парамет-, рам для системы НАБ/РАЙК. Уровень продукции вирусного антигена достаточен для изготовления диагностических препаратов к гепатиту А.1 П р и м е р 2. Штамм ВГА Л- продуцент вирусной массы для изготовления инактивированной вакцины для специфической профилактики гепатита А.Выделение вируса из фекалий и адаптацию штамма Лк размножению в культуре клеток РВЬКпроводят как описано в примере 1, но штамм ВГА Ладаптируют к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647,Адаптацию штамма Лв культуре клеток 4647 проводят следующим образом.Хорошо сформированный монослой клеток 4647 инокулируют в течение 2 ч при 37 С вирусосодержащим материалом, полученным путем разрушения 5-кратным замораживанием (оттаиванием зараженных клеток, собранных на 44 сут третьего пассажа штамма ВГА Лв культуре клеток РЕ 1 К). Для последующего пассирования вируса используют лизат зараженных штаммом ВГА Лклеток, собранных на максимальный срок размножения предыдущего пассажа. В качестве среды роста и среды поддержания используют среду ИглаМЕМ 103 и эмбриональной телячьей сыворотки 1 Х. Условия культивирования те же, что и в примере 1, за исключением температуры инкубации. Как видно из,описанных данных, по мере пассирования происходит адаптация штамма ВГА Лк культуре 464, Достигнутый на уровне 74171 6третьего пассажа штамма ВГА Л уровень продукции вируса сопоставимс ранее описанным для системНАЯ/464, что позволяет создаватьпрепараты инактивированной вакциныпротив гепатита А,Данные адаптации штамма вирусагепатита А Лк перевиваемой 10 культуре клеток почек зеленой мартышки 4647 приведены в таблице. 115 Штамм вируса гепатита А ГИСК 1177 для.накопления биомассы, используе-. мой для приготовления профилактических и диагностических препаратов. 40 В качестве инокулума используютвирус полученный на 44 сут в результате третьего пассажа в культуреклеток РБМК(пример 1).