Способ исследования реакции антигена и антитела

ПИСАНИЕ ивниийЙЖ%ВНЛВЯМьс =:-" - :.ми,ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик О щ 652865=-" Й Й А МН 1 У тенту ополннтельный Ено 2 ом 8.01 м.7 мб(т 21)231 9108 т/28 у 13 мритбт - (32) 29.01.76и 22) Заяв 23) При 51) М 10/00 33/16 ретеекнюк кемететСССРеиам кзебретвкквк еткрыткк 1) 545066 Гав.щеи шип,мтие=:м . -убликовано 15.03.7 9 йвшш иеаишмвевиеившшедвтм.ыо",вымев та опублйкования оп Бюллетень10 и мювешу исайймя 20.03.7 Йнос Лчтер,"ДжПоле Прай Инос трай "Баксттемрб Л транцыером Кремарон и К; (США) Вджи 72) Авторы изобретения ен, Родольфо Родригесрлтон Дитон 71) Заявител з, И ная фирм аборатор(США) иеюЫОог:ЙМММв им вше иомеме; св ммвннтвмине; кЬйсЖввдитиеемвив(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕАКЦИИ АНТИГЕНА" ": И АНТИТЕЛАмфйвеффффффуФ Ф, си.,ж мимир-. +О ИеийишеИйЯщне ".евииероешвеетерееыеотев уииииеии1Изобретение относится к областй=ье-"" " Геионное поверхностно-активное ве-меодвввп: .ввившвеву,в"- Ивов и рды нинины в именно и иммунопогии.,шество н попнэтипенгпииопь берут в соИевеетен способ исспедоввиУйбресед иНиет" отиодшменеи 3:1.антигена и антитела путем инкубаоцйй"Инкубацию ведут в присутствии реаисследуемого материала в присутствии 5 гента, представляющего собой водный реагента, способствующего водораствори-раствор смесиппоглтйтэстоипленгпиколя и не- мости комплекса антиген-антитепо,"сионного поверхностно-активного вещест- последующим фиксированием реакций ать : ва.глютинации 11. -"ь; =-Соотношения попиэтиленгликоля иОднако известный способ не обеспе-Ю неионного поверхностно-активного вечивает высокой точности исследования. щества в смеси могут иэменяться в широких пределах, главным образом в заЦелью изобретения является повЬше=висимости от используемого поверхностние точност следования;. -, - -" -,"но-активдйогиовещестова. Йапмример, смесь,:-";.";,.:;:.=.-:;- ="-.-1 Ьсодержит мйрймерно от 10 до 90 вес,%ЭтО дОСтИГаЕтСя тЕМ, ЧтОПО йбрбйпад- ПОЛйетйгПЕНсГопИКпОопмя И От 90 у дО 10 ВЕС.% гаемому способу инкубацию ведут в- -" неионного поверхностно-активного веще- присутствии 3,0-6,0 весе% смеси, содер- ства, предпочтительно смесь содержит жащей 10-90 вес.% полиэтиленгликоля ,от 15 до 85 вес.% полиэтиленгликоля и 90-10 вес.% неионного поверхностно- б 0 и Ь 5-15 вес % неионного поверхностно- активного вещества. - активного вещества.В качестве неионного поверхоойостнгио- ; Й качестве полиэтнленгликольного активного вещества используют сополи- компонента смеси испольэуют один или"- мер окиси этилена и полиоксипроййлойа"."нескЪлыо тйпОвэиспсолйэгйлейглйколей. и ис э и э,Вив мВн 4 ииидеи. иди ебИспользуемый полимер полиэтиленгликоля обычно имеет молекулярный вес от 200 до 10000, предпочтительно от 4000 до 6000.Ненонный поверхностно активный ком понент смеси может быть любым неионным поверхностно-активным веществом, которое обеспечивает в растворе реагента рассчитанное значение гидрофипьнолипофильного баланса от 0,7 до 1,7м предпочтительно от 0,7 до 2,3"при кон-. концентрации смеси от 3 до 6%. Неионное поверхностно-активное вещество и попиэтипенгпикопь присутствуют в смеси в соотношении 3:1.15Предпочтитепьным поверхностно-активным веществом являются бпок-сопопимеры окиси этилена и попиоксипропилена. Эти блок-сопопимеры содержат примерно 50%Ю окиси этипена в молекуле, а мопекупярный вес гидрофобного основания полиоксипропипена составляет не менее 950.Предпочтительными блок-сополимерами являются полимеры Ги Р -6825 Рбцгонфс Г 38 содержит 80% полиоксиэтнпеновых гидрофип ьных звеньев в мопекупе, а поииоксипропипеновое гидрофобйое основание имеет молекулярный вес 950. -68 содержит 80% попиокси 30 этиденовых гидрофильных звеньев в моле-. купе, а гидрофобное основание имеет мопекупярный вес 1750.Раствор реагента содержит примерно одну часть по весу попиэтипенгликоля, имеющего мопекупярный вес примерно 4000 и около 3 частей по весу материаля Рйцгощс 1-38. Этот реагент готовят в солевом растворе (например, 0,9%йаСф, инкубацию ведут в присутствии 3,0-6,0 вес.% смеси, Предпочтительно раствор приготовпяют в виде 8% раствора смеси попимера в сопи, который затем разбавляют антисывороткой, пибо другим приемпемым разбавитепем перед иопопьзованием его при исспедовании реакции.Можно использовать н другие неионНые поверхностно-активные вещества в качестве добавки и полиэтипенгпикопю в50 растворе реагента.Например, можно использовать неион ные поверхностно-активные вещества ТЕТИНО М 1 С Молекулярный вес55 этих веществ может изменяться примерно от 1650 до 26000, предпочтитепьные поверхностно-активные вещества имеют молекулярный вес от 15000 по 27000 и значение гидрофильно-пипофипьного бапйнса от. 20 до 30,5,Используют также неионные поверхностно-активные веиаства Р 10 РАГА С,имеющие значения гидрофипьно-липофидьного баланса от 10 до 20, и используютих в разпичных соотношениях с попиэтипенгпикопем,Другие, пригодные неионные поверхностно-активные вещества вкпючают моностеарат глицерина и семейство апкип-арил-супьфонатов. При выборе неионного поверхностноактивного вещества спедует использоватьтакие вещества, которые обладают способностью давать прозрачный растворреагента при исследовании реакции антигена и антитепа. Это гарантирует, чтореагент не, новпияет на резупьтат анапиза, ипи не вызовет неспецифическогоосаждения компонентов биологическогообразца ипи биопогических реагентов.Реагентможно испопьзовать для увеличения относительных концентраций нерастворимых комппексов антиген-антитепо и увеличения исследуемого диапазонаичувствительности данной системы анаслиза.Можно использовать эти реагенты вдругих системах анализа, основанных наосаждении антитела, например в радиоиммунодиффузионном, энзиматическоманализах и в различных видах электросфоретических способов, например в иммуноэлектрофорезе в протнвоэлектрофорезе и в электроиммуноднффузионном анализе н других способах.,П р и м е р 1. Раствор реагентапопучают смешиванием 25 вес.ч попиэтипенгпиколя, имеющего молекулярныйвес 4000, с 75 вес.ч. Р 1.ЦЙОМ 1 С Р и смесь растворяют в нормальном солевом растворе (0,9% КОСЮ ) до концентрации 9 вес,% указнной смеси. Этотраствор можно пибо разбавить, например,антисывороткой, до концентрации смеси4% (значение гидрофильно-пипофипьногобапанса Н В - 1,115) перед инкубированием и испопьзовать непосредственно в процедуре иммунопогического анапиза, либо его можно держать при концентрации 8% до тех пор, пока он не будет готов дпя испопьзования,П р и м е р 2, Повторяют пример1, за тем искпючением, что заменяютпопяэтипенгникопь, имеющий мопекулярный вес 4000, эквивалентным копичест652865 г6 вом материапа с мопекупярнымиЪесом". -" Пробирки перемешивают инверсией и 6000. инкубируют в течение 1 ч при комнатП р и м е р 3, Повторяют пример 1, ной температуре (20-25 С) за тем исключением, что заменяют"Р 60- Пустые образцы готовят, испопьзуя,ЙХМ %;: Зиад".иИ.ии 1.И,т; и гочс Р -38 эквивапентным копичест "1 мпотфйпьтрованных, реагентов иэ вом Г, =; . - , - .-.:=-. - , - ,.; - ,.примеров 1-4 (в зависимости от спучая),П р и м е р 4. Повторяют пример 1,. попученных так, как описано выше, за за тем исключением, что заменяют Гтем искпючением, что 8%-ный раствор на разп ичные количества Те 1 гомс 7 07, разбавпяют сопевым раствором, вместо 908, 1107, 1307, 1508; Рбнга 1 ас 10 антисыворотки, Пустые образцы помешают 17 Я 8, 25 ц 8,Х)25, АЗ 8 и АЗ 9; РВого в идентичные помеченные пробирки, п 1 с Ь 125, с 1 Васева 165; и С-ЗООО,Одинаковые объемы контрольного и в ряде опытов, чтобы попучить бопьшое исследуемого образцов добавляют в кажмногообразие растворов реагента. дую пробирку как указывалось выше.П р и м е р 5. Растворы иммуниойо гических реагентов, попученные в "приме-" " Все йробйрки исследуют -в лвзеркомрах 1-4, испопьзуют в отдепьных нефе- нефелометре для относительного светораслометрических анализах иммуноглобупинов сеяния, (1 дА, 1 С, 1 М), комппемента СЗ Пустые пробирки (нупевые значения) и трансферрина, причем каждый анализ были измерены и вычтены электронной проводят спедуюшим образом -., - -. :.-:.-: . схемой из эйачений реакции при йомощиКонтрольные образцы 1-6 (йзЖс 1 йо="прибора. го анализа) для каждого указанного био- - Койтролькые значения наносят на лилогического компонента разводят в соотгнеиной миллйметровке в виде графической ношении 1:100 в растворе соли," " зависимости относительного процентаНеизвестные затем также аналогичйо светорассеяния от концентрации контройь-разводят в соотношении 1:100 в сопевом ных образцов. растворе. Неизвестные значения опредепяют пуПредварительно разведенные анти- тем -считывианиязначения"из графическойим 5.Р . Я сыворотки к 1 С, 1 дМ, 1 А, СЗ и к зависимости контропьных образцов, трансферрину разводят по отдепьйоситй вИммунологическйе реагенты, используе- соотношении 1:2 8%-ной смесью имму-" мые в" этом образце, даютсущественно нопогического реагентов из примеров=" " большее осаждение комплексов антйген-3 ипи 4 (в зависимости от спучм) и антитело, обеспечивают большую линейсмешивают инверсией, чтобы поийучйть"и"ность в более широком диапазоне и боль%-ную концентрацию попиэтипенгпйкиопя шую чувствитепьность, чем в спучае реви неионного поверхностно-активного ве-гента, содержащего только одйн попиэтищества в растворе и рассчитанное значе- пенгпикопь,и ние гидрофипьно-пипофипьного бапанса П р и м е р 6. Исйользование им 40 НЬВ от 0,7 до 1,7 во всех слуФЙх."-мунологического реагента по предпагаеАнтисыворотку фильтруют черезмому способу в процедуре радиоиммуно,45-микронный фильтр миллипоры. анализа для определения тироидных стиПриготавливают ряд эксперименталь- . мулируюших гормоновчеловека (НТН). ных пробирок (10 мм х 75 ммоткрытые , Образец иммунологического реагента пробирки дпя купьтуры), соответственно получают смешиванием 8,4 мл 5%-ного помеченных: пустая, контрольные 1, 2, 3,раствора полиэтиленгликоля в 0,9%-ном 4, 5 6 и неизвестная,- ,:,-,",.,-,"солевой растворе с 20 мп 6%-ного неК каждой пробирке добавляют 1 мл . ионного поверхностйо-активного вещестразбавпенной смеси антисыворотки й реа- ва РВцгопс Г -38. Объем смеси затем гента. йй -=-.-",: доводят до ЗО мп при помощи 0,9%-ногоК соответствующим пробирка добав .раствора сиопи, чтобй получить в реагенпяют по 25 микропитра растворов"контр%:=- теокончатепьную концентрацию 1,4% пьных и неизвестных ппя 1 С, 1 А и поппэтипенгпикопя и 4,2% Р-.38. трансферрины (100 микролнтров"дйяи"и .Радиоиммуноанализ проводят спедую И и СЗ). шим образом,В соответствующую пустую пробирку 0,050 мп вити НТ Н кропика с позаливают 25 ипи 100 микропитрбЬ"сопе",. гпощенным хориойным гонадотропином вого раствора. мыйМ "ч-"-":""(НОб) смешивают с 200 мл НТЬН конт-.ъ". :".1 . ю в, .6528 Составитель С, МалютинаРедактор Н. Батанова Техред И. Лсталош Корректор П. МакаревичЗаказ 1082/56 Тираж 671 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений н открытий113035; Москва, Ж, Раушская наба. 4/5 Филиал ППП фПатент, г. Ужгород, уп. Проектная, 4Мгтк, 7ф, .,фрольнйхобразцов различной сины. Затемк смеси добавляют 50 мп фосфатногобуфера с рй 7,4 и смесь инкубируют втечение 2 ч при 37 Ч. В этот моментдобавщаот О,100 мл НТЗН, меченного 3йодом ХИБ, и смесь и кубируют еще втечение 3 ч при 37 С. Затем добавляют0,1 выщепопученного реагента и смесьиниубируют в течение одного часа прикомнатной температуре. Вследствие раэ- Юбавпения реагента при добавления к смеси концентрации попиэтнпенгпикопя и Г уменьщилнсь от значений 1,4% и 4,2% дозначений 1% и 3% по весу соответственно. Смесь центрифугируют при 1000 х ф 1%и течение 10 мин. Если требуется про., мывка отцентрифугированного твердоговещества, то раствор дпя промывки-должен содержать ту же концентращпо, чтои реагент в тот момент, когда реагентвпервые используют в анализе, т.е. 1%полиэтипенгпиколя и 3% Г. Плавающую сверху жидкость декантируют а осадок исследуют. Згу процедуру повторяютдпя различных контрольных образцовНТб Н и получают калибровочную кривую,.нанося число распадов в различных осадкахв зависимостн от концентрации соответствующего контрольного образца НТБН,При попученни калибровочной кривойпроводят анализ неизвестного пробногообразца, используя процедуру, описаннуювыше, за исключением того, что контрольный образец НТ 5 Н заменяют исслеДуе 35мьм образцом, Содержание НТЗН в исследуемом образце затем легко опре деляю 1, исходя из попожения числа распадов осадка на калибровочной кривой.-Использование раствора реагента увеличивает степень осаждения, которая получается больше той, которую можно по лучить с реагентом, использующим толь ко один попиэтипенгпиколь, и это приводит к упучшенщо радиоиммуноанапиза.Предлагаемый способ обеспечивает повышение точности исследования, умень шается время инкубации, повышаетсячувствительность.,Формула изобретения1 Способ исследовании реакции антигена и антитела путем инкубапин исследуемого материала в присутствии реагента, способствующего водораствори- .мости комплекса антиген-антитело, споследующим фиксированием реакции агь-глютинацнн, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повьпдения точности исследованйя, ннкубацню ведут в присутствии 3,0-6,0 вес.% смеси, содержащей10-90 весЛ полиэтиленгликоли и 9010 вес.% ненонного поверхностно-активното вещества.2. Сйособ по п.1, о т п и ч а ю -щ и й с я тем, что в качестве неионного поверхностно-активного вещества иопопьзуют сополимер окиси этилена и попноксипропипена.3. Способ по п.1, о т л и ч а ю -щ .и й с я тем, что неионное поверхностно-актпвное вещество и попиэтипенгпикопьберут. в соотношении 3;1,Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1, Х,И 1 и 1 са 6 СИВвъЫ 3 ъ 20, 1974,р. 415-420,