Способ определения витамина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН З 1) С О 1 И 31/08 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) 1. ОачЫе Л., В 1 аггпа 1.СЬгошаГщгарЬУ оГ Гаг-зо 1 иЫе ч 1 гаш 1 пз опгЬ 1 п - 1 ауегз оЕа 1 аш 1 па.- "СЬгошао 8 г", 1962, ч. 7, У 42, р204-210.2. Федорова Г.А. Исследования в области анализа витамина К . Автореф. дисс. М., 1978 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА К путем экстракции его из анализируемой пробы органическим растворителем, очисткой экстракта с последующим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе, содержащей гексан, удалением целевого компонента с пластинки и фотометрированием, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения эффективности и точности способа, в качестве органического растворителя используют бензол, содержащий 1-2 об.7. н-бутанола, и в качестве подвижной фазы используют гек-сан - хлороформ при объемном соотношении компонентов 46-52:54-48.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе ния витамина К путем экстракции его из анализируемой пробы органическим растворителем с последуюшим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля, в подвижной фазе, содержащей гексан, удалением целевого компонента с пластинки и фотометрированием, в качестве органического растворителя используют бензол, содержащий 1-2 об.7 н-бутанола и использование в качестве подвижной фазы гексан - хлороформ при объемном соотношении компонентов 46-52:54-48. Изобретение относится .к аналитической химии, в чаСтности к способам определения филлохинона (витамина К), и может использоватьсяв различных аналитических лабораториях.Известен способ определения витамина К 1 в экстрактах растительныхматериалов на пластинке, покрытойслоем окиси алюминия с использованием в качестве подвижной фазы гексана и реактива обнаружения 17.-ного раствора 2,6-дихлорфенола или707-ной перхлоруксусной кислотыи индофенола 13Недотатком данного способа является недостаточно высокая эффективность разделения витамина К1 и сопутствующих компонентов (степень разделения не превышает 1,1).Наиболее близким по техническойсущности и достигаемому эффекту кпредлагаемому является способ определения витамина К путем экстрагирования его из образца гексаном,очисткой экстракта с последующимхроматографированием экстракта напластинке со слоем силикагеля вподвижной фазе гексан - эфир, присоотношении компонентов 4:Т, удалением целевого компонента с пластинки и фатоиетрированием 2 1,Недостатком известного способаявляется недостаточно высокая эффективность разделения целевого исопутствующих компонентов (степеньразделения не выше 1,27) и относительно малая точность определениясодержания витамина К 1.Целью иаобретения является повышение эффективности и точности способа. 1 О2025303540 На чертеже представлен калибровочный график для определения количества витамина К, в экстракте из растительного материала.Определение витамина К проводят следующим образом.Навеску травяной муки вносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 10 мп экстрагирующей смеси - бензол, содержащий 1-2 об.7 н-бутанола, и ставят в темное место на 3 ч. Далее содержимое пробирки пропускают через колонку диаметром 8-10 мм, заполненную силикагелем и безводным сульФатом натрия, а пробирку ополаскивают пятью порциями по 5 мл экстрагирующей смеси, которые также пропускают через колонку. Фильтрат выпаривают на роторном испарителе при 75-80 С и сухой остаток растворяют в 0,2 кп бензола.Затем, с помощью микропипетки, переносят количественно полученный раствор на пластинку "Силуфол" и по обе стороны от образца нано- . сят раствор - свидетель витамина К.Хромато графирование ( восходящее) проводят в камере для тонкоспойной хроматографии, насыщенной парами подвижной фазы гексан - хлороформ, взятых в соотношении 46-52:54- 48 об,7. После того, как фронт растворителя дойдет до верхнего края пластинки, ее вынимают, просушивают и быстро определяют положение витамина К по свидетелю под ультрафиолетовой лампой - обнаруживается в виде темной полосы. Пятно силикагеля с адсорбированным витамином соскабливают с пластинки, переносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 3 мл 967-ного этилового спирта и ставят в темное место на 30 мин для элюирования витамина. Затем элюат отфильтровывают через бумажный фильтр, смоченный этиловым спиртом, пробирку и фильтр ополаскивают 2 мл этанола. Далее фотометрируют элюат при длине волны 281 нм, переливают его в стеклянную центрифужную пробирку и облучают (сверху) лампой дневного света, расположенной на высоте 5 мм над пробиркой, в течение 7 ч, Затем повторно фотометрируют элюат при той же длине волны и по разнице показаний между пергде Х - содержание витамина К в 1 гтравяной муки, мкг,1 ОЕ - оптическая плотность исследуемой пробы до облучения;Е - оптическая плотность исслегдуемой пробы после облучения;155 - объем элюата витамина Кпосле хроматографирования,1000000 - коэффициент пересчета гв мкг;309 - прирост Е, 7;100 - объем раствора, содержащего 1 г витамина К, мл,А - навеска исследуемого материала, г.25П р и м е р 1, Берут 500 мг.травяной муки, вносят навеску впробирку с притертой пробкой, заливают 10 мл экстрагирующей смеси -бензол, содержащий 2 об.7 н-бутанола (к 10 мл бензола добавляют0,2 мл н-бутанола) и хорошо перемешивают. Пробирку ставят в темноеместо на 2 ч. Заполняют колонку диаметром 10 мм слоем силикагеля(2 см) и сверху него насыпают 1 смбезводного сульфата натрия. Содержимое пробирки пропускают черезколонку, а пробирку ополаскиваютпятью порциями по 5 мп экстраги 40рующей смеси, которые также пропускают через колонку. Фильтрат выпаривают на роторном испарителепри 80 С и сухой остаток растворяютв 0,2 мл бензола.Затем с помощью микропипетки переносят полученный раствор (0,2 мп)на пластинку "Силуфол", размером15 15 см, и по обе стороны образо"вавшейся полосы наносят свидетельраствор - 5 мкг филлохинона в0,1 мл хлороформа.Развитие хроматограммы проводятв камере (180 70 170 мм), насыщенной в течение 30 мин парами смеси55растворителей гексан - хлороформ,взятых в объемном соотношении50:50. После того, как фронт подвижной фазы поднимется на высоту 20 35 45 вым и вторым измерениями определяют прирост экстинции.Расчет содержания витамина К 1 в исследуемом образце проводят по формула 5(Е 2 Е ) 5 1000000309 100 А 15 см, пластину вынимают из камеры, просушивают и быстро определяют положение витамина К по свидетелю под ультрафиолетовой лампой (проявляется в виде темной полосы).Пятно силикагеля с адсорбированным на нем витамином К соскабливают с пластинки, переносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 3 мп 963-ного этилового спирта и ставят в темное место на 30 мин. Затем отфильтровывают раствор через бумажный фильтр (красная полоса), смоченный этиловым спиртом, пробирку ополаскивают 2 мл этанола, который переносят на тот же фильтр. Далее фотометрируют фильтрат при длине волны 28 1 нм, переливают его в стеклянную центрифужную пробирку и облучают (сверху) лампой дневного света, расположенной на высоте 5 мм над пробиркой в течение 7 ч. Затем проводят повторное фотометрирование и по разнице показаний между первым и вторым измерениями определяют прирост экстинции и определяют количество витамина К 1, процент его извлечения и величины К сопутствующих компонентов. При этом количество витамина К определяемое по калибровочному графику (чертеж), заключено в диапазоне 5-30 мкг (2-6 мкг/мл).В предлагаемом способе определено содержание витамина К на уровне 16,8 мкг/г (при 1002 извлечении) и величины К - для витамина К равной 41, для р -каротина 87, Ы -токоферола 26, в то время как в известном способе величины К рав ны 62, 79 и 38 соответственно, Степень разделения витамина К и сопутствующих ему компонентов составляет в предлагаемом способе 1,6- 2,12, а в известном - 1,27-1,6.П р и м е р 2. Осуществляют определение витамина К 1, аналогично примеру 1, но в качестве подвижной фазы используют смесь гексанхлороформ, имеющую состав 46:54 об,У Результаты предоставлены в табл. 2.П р и м е р 3. Осуществляют определение витамина К, аналогично примеру 1, но подвижная фаза гексан - хлороформ имеет состав 52-48 об.7. Результаты представлены в табл. 2.П р и м е р 4. Осуществляют определение витамина К, аналогично1109631 Таблица 1 Состав подвижной Фазы, об, Е Компоненты 20 30 40 50 60 70 80 70 60 50 40 30 99 94 90 87 76 73 77 58 49 41 34 31 51 35 31 26 18 14 80 Гексан 20 ХлороформК каротинаКвитамина КК токофенола 18 Таблица 2 Компоненты Ге ксан 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 58 56 54 52 50 48 46 44 42 40 Хлороформ Определено витамина К. р Ж 97,9 97,6 99,7 99,8 100 101 99,0 98,2 97,1 96 рримеру 1, с подвижной фазой гекр 4 н - хлороформ, имеющей различныйрбъемный состав, Результаты предатавлены в табл. 2,П р и м е р 5. Осуществляютопределение витамина К, аналогичнопримеру 1, анализируя усредненныйобразец люцерновой муки, содержащий19 мкг/г основного компонента. Параллельно проводятся анализы этогоже образца по известному способу.Результаты экспериментов представлены в табл, 3,Данные табл. 1-3 свидетельствуюто том, что оптимальным соотношениемгексана и хлороформа в подвижнойфазе является интервал 45-52:ф 54-48 об.7. В этих пределах достигается наиболее точное определение витамина К в исследуемом образце травяной муки и наилучшая эффективность разделения. В качествеэкстрагентов витамина К из растительного материала используетсябензол в смеси с н-бутанолом. Сравнительный анализ выхода и определяемого количества витамина К, из од ного и того же образца при различном составе экстрагирующей смесиописывается следующим примером.П р и м е р 6. Определение витамина К проводят, аналогично при меру 1, но в бензол добавляют1,5 об.7 н-бутанола. Результатыпредставлены в табл, 4,Таким образом, предлагаемый спо соб характеризуется повышенной эффективностью разделения витамина К,и сопутствующих ему компонентов(степени разделения увеличиваетсяна 25-327), кроме того повышается 20 точность определения количества витамина К в образце (величина стандартного отклонения уменьшается от3,8 до 0,05). Состав подвижной фазы, об.71109631 Таблица 3 Количество витамина Количество витамина К в 1 г травяной К в 1 г травяной тки, мкг муки + 10 мкг стандарта витамина Кмкг к , витаминаК Возврат витамина К,ХПредлагаемый способ 40 98,2 19,11 98,1 41 98,2 39 98,3 42 98,0 41 98,2 18,99 Известный способ 62 93,2 68,33 60 63,51 94,9 64 91,8 73,6165,29 62 95,9 67,71 90,4 61 60 90,5 71,98 Таблица 4 Компоне нты Бензол 100 99 5 99 0 98 5 98 0 97 0 96 0 н-Бутанол 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 Количество витамина К; мкг/г 16,80 16.,86 17,43 17,41 17,43 17,08 16,9294,6 96,6 100,0 99,9 100,0 98,0 97,1 Е извлечения 19,08 18,98 19,04 19,00 28,93 28,89 28,79 28,87 28,80 28,81 77,6573,00 82,79 74,88 76,75 81,03 Состав экстрагирующей смеси, об.71109631 Составитель В. РезниковРедактор Г. Волкова Техред Ж. Кастелевич Корректор М Шаро сное иал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная Заказ 6021/28ВНИИПИ Госудпо делам113035, Иоскв Тираж 823 Порственного комитета СССРзобретений и открытийЖ, Раушска наб. д. 4/