Способ исследования молока на содержание жира и белка

. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(72) В.Ю.Домбровский, В.С.Данильчик, В.П,Панферов.и Л.А.Василевская (71) Белорусский государственный институт усовершенствования врачей и Белорусский научно-исследовательский институт охраны материнства и детства(56) 1. Методические рекомандации по лабораторному исследованию женского молока. Киев, "Наука", 1979, с. 7-11.2. Авторское свидетельство СССР У 412549, кл. С 01 И 33/04, 1981./4)(57) 1; СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ЖИРА И БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для получения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуе мой пробе, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и обеспечения возможности одновременного определения содержания в исследуемой пробе углеводов, органический растворитель добавляют к отобранной .пробе в соотношении 90: 1, затем удаляют осажденный белок иэ обезжиренно" го раствора и вводят в последний воду для получения водноорганической смеси с последующим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жиром и углеводами путем ,введения реактивов соответственно в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и у леводов в исследуемой пробе.2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ н й с я тем, что в качестве органического растворителя используют смесь Фолча, а в качестве реактивов для получения цветных комплексов с белком, жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофосфовайилиновьэи и антроновый реактивы.30 1 10895Изобретение относится к биологиии медицине, в частности к способамисследования состава женского молока.Известны способы определения бел 5ка, жира и углеводов в молоке, предусматривающиеопределение белка вальбуминометре или с помощью методаКьельдаля, определение жира бутирометрически или путем центрифугирования, определение углеводов путемтитрования раствором Бенедикта1 3.Недостатком указанных способовявляется их невысокая специфичностьи точность, значительная трудоемкость и необходимость в относительнобольшом количестве молока (5-20 мл),причем каждый нутриент определяетсяв отдельной пробе молока. Это делает невозможным исследование состава женского молока указаннь 1 ми способами в клинико-диагностических глабораториях лечебно-профилактическихучреждений.Поскольку количество материала(женского молока), которое можновзять для исследования без ущербадля ребенка, ограничено, особеннов первые дни лактации из-за малогоколичества образующегося молока.Известен также способ исследова-ния молока на содержание жира ибелка, предусматривающий отбор пробы,экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для получения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значения оптической плотности, про 40 порциональной количесву. белка в исследуемой пробе Г 21.Недостатками такого способа являются неполная экстракция жира спир" тово-эфирной смесью и недостаточная точность его определения весовым45 методом в сочетании со значительными затратами времени, а также невысокая специфичность химических реакций для определения белка и лактозы, что значительно снижает точность и50 в достовернос определения.Цель изобретения - повышение точности определения белка и жира в одной пробе молока с одновременным определением в этой же пробе содержания углеводов.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу исследова 16 2ния молока на содержание жира и белка, предусматривающему отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для поЛучения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметривание и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуемой пробе, органический раствори- тель добавляют к отобранной пробе в соотношении 90: 1, затем удаляют осажденный белок из обезжиренного раствора и вводят в последний воду.для получения водноорганической смеси с последующим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жиром и углеводами путем введения реактивов соответственно в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе.Кроме того, в качестве органического растворителя используют смесь Фолча, а в качестве реактивов для получения цветных комплексов с белком, жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофосфова- нилиновый и антроновый реактивы. Для осаждения белка и одновременного полного извлечения жира и углеводов из молока применяется смесь Фолча (хлороформ:метанол = 2:1), которую добавляют к исследуемой пробе молока в соотношении 90: 1, полученную смесь встряхивают и центрифугируют, в результате чего образуется белковый осадок и супернатант, содерФжащий жир и углеводы, который отделяют от,осадка путем добавления во- ды разделяют на водную и органическую фазы, содержащие, соответственно, углеводы и жир, Смесь Фолча и молоко смешивают в соотношении 90:1, поскольку установлено (табл. 1), что при уменьшении количества смеси Фолча не происходит полного осаждения белка и полной экстракции жира (углеводы экстрагируются полностью), а при увеличении количества смеси фолча, наряду с полным осаждением4Наличие белка, жира и углеводов в осадке и супернатанте при различном соотношении смеси Фолча и молока приведено в таблице 1. 1089516 белка и полной экстракцней жира,наступает нежелательное разведениесупернатанта с уменьшением концентрации в нем жира и углеводов. Таблица 1 Соотношениесмеси фолчаи молока Осадок Супернатант жир углеводы белок белок углеводы жир 70:1+ Для определения количе жира и углеводов в иссле бе молока используют кал кривые, построенные на о определения указанных ну риентов Примечание. Наличие белка, жира и углеводов в осадке и супернатанте определяют: белка - биуретовым методом, жира - сульфофосфованилиновым методом, углеводов - с антроновым реактивом; "+" - данный компонент в пробе присутствует; "-" - данный компонент впробе отсутствует.аК полученному осадку белка добав . эталонных .растворах: для белка - вляют биуретовый реактив, к отобранно- растворе альбумина с содержаниемму образцу водной Фазы в , антроновый его 5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л фиг.1),реактив, к отобранному и выпаренному для жира - в растворе триолеина сдосуха образцу органической Фазы . содержанием его 10, 20, 30, 40, 50,серную кислоту и фосфованилиновый 45 60 г/л (фиг. 2) для углеводов - вреактив. Оптическую плотность полу- растворе лактозы с концентрациямиченнык при этом цветных комплексок 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 г/лизмеряют на фотоэлектроколориметре (фиг3) .На фиг. 1, 2 и 3 показаны графики, , Реактивы, необходимые для осущестзависимости измеренной величины б вления предлагаемого способа.оптической плотности от содержания 1. Смесь фолча (хлороформ:метасоответственно белка, жира и углево- нол = 2: 1),дов. 2. Биуретовый реактив: б - 4,5 гства белка, сегнетовой соли (КЯаСНО)растводуемой про ряют в 40 мп 0,2 н. ИаОН, после чеибровочные го прибавляют 1,5 г Си 80 ф 5 Н 20 и.сновании 0,5 г КХ; раствор доливают до 100 млт в 0,2 н. ЯаОН, хранят в темном месте;516 арабочего слоя 10 мм. В пробирку ссупернатантом добавляют 1,5 мл дистиллированной воды, тщательновстряхивают в течение 1 мин и центрифугируют 5 мин при скорости1000 об/мин для расслоения на 2 фазы - водную (верхнюю) и органическую (ннжнюю). В водной фазе определяют содержание углеводов, К 0,2 мпводной фазы прибавляют 2,3 мл антронового реактива, перемешивают, ставят на 15 мин в водчную баню с температурой воды 100С, охлаждают и колориметрируют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре в кювете с.толщиной рабочего слоя5 мм. В органической фазе определяют содержание жира. 0,2 мл органической фазы переносят в чистую обезжиренную пробирку, выпаривают досуха при 80 С, добавляют 0,45 мл концентрированной серной кислоты,тщательно встряхивают пробирку, помещают в кипящую водяную баню на20 мин, после чего охлаждают, добавляют 1,75 мл фосфованилинового реактива, тщательно перемешивают и через 1 ч колориметрируют на фотозлектроколориметре при зеленрм светофильтре в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мм, Фотометрию проб при определении жира и углеводов проводят против контрольных проб, которые обрабатывают так же, как и опытные, только вместо 0,05 мл молока берут 0,05 мл воды.Примеры определения белка, жира и углеводов в пробах молока приводятся в табл. 2Таблица 2 4,7 0,2 О, 190 0,2 15 12 0,215 0,070 0 7,7 0,155 44,6 0,2506 0 180 518 0270 671 62,ины С (концентрации белка,ответствующим калибровочнымординат которых отложены велпо, осям абсцисс - концентра мечание. Велипо с осям Е, а 1089 реактив устойчив в течение 1 мес; Е - 0,5 Х раствор К 1 в 0,2 н. ЯаОН, Реактив устойчив 2 недели.Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл реактива смешивают с 80 мл реактива о. Хранят в темноте. Реактив устойчив 2 недели.3, Серная кислота, концентрированная по Савалю.4. Фосфованилиновый реактив: 1 ч 1 О 0,67-ного водного раствора ванилина смешивают с 4 ч. концентрированной ортофосфорной кислоты. Смесь хранят в посуде из темного стекла при комнатной температуре. 155. Антроновый реактив: к 34 мл воды приливают 66 мл серной кислоты уд.в. 1,84 охлаждают, добавляют 50 мг антрона и 1 г тиомочевины, перемешивают, нагревают .до 80.в С. Реактив устойчив 2 недели в холодильнике в темной бутылке.П р и м е р. В пробирку, содержащую 4,5 мл смеси Фолча, приливают 0,05 мп молока, тщательно встряхивают в течение 1 мин, центрифугнруют при скорости 3000 об/мин в течение 5 мин и супернатант количественно сливают в чистую пробирку. К осадку добавляют 1 мл биуретового реактива, тщательно перемешивают на вихревом смесителе в течение 1 мин и оставляют на 30 мин при комнатной температуре для развития реакции и образования комплекса сине-фиолетового35 цвета, после чего проводят фотометрию против биуретового реактива на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре в кювете с толщиной ира и углеводов) определекри ым (фиг. 1, г и 3), пнчины оптической плотностии определяемых веществ.1 1По сравнению с известным предлагаемый способ позволяет повысить .точность определения белка, жира и , углеводов за счет применения смеси фолча, полнее экстрагирующей жир, чем спиртовоэфирная смесь, .и использования высокоспецифичных химических 089536реакций для определения белка, жира и углеводов, кроме того, количество молока, необходимое для определения белка, жира и углеводов, 5 уменьшено в 40 раз, а времяопределения сокращено в 3 ра