Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 101 9) Я БРЕТЕНИЯ САНИ ТОРСН СВИДЕТЕЛЬСТВ(лей нерая и и орден осударст Ульянотельство ССС 9/22, 1976, др. РибонуклеОчистка хроекот 4, вып. 4 ототип), Вф ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(7 1 ) Казанский орден а Лени наТрудового Красного Знамени г(56) 1, Авторское св)иде587156, кл, С 12 М2, Голубенко И. А. иВасЖоь 1 п 4 егвеа 1 пэ 7 рматографией на фосфоцеллюпозе и нрые характеристики гомогенного прота, -"Биохимия", т, 4 , М1979, с, 640-647 (пр С 12 И 9/22; С 12 М 1/2(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ШЕЛОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ Вас 1 Иоэ 1 пСегтейпв Чр,включаюший глубинное культивированиепродуцента на питательной среде, сойержашей источники углерода, азота, минеральные соли, биостимулятор, коагуляциюбиомассы и кислых белков подкислениемдо рН 26-30 осаждение белка сульфатом аммония и фракционирование фермента на фосфоцеллюлозе, о т л и ч а юш и й с я тем, что, с целью повышенияактивности рибонуклеааа в культуральнойжидкости и выхода целевого продукта, вкачестве биостимулятора используютдрожжевой экстракт иликислотный экс-.тракт продукта "Витамин В. ъ кормовойв количествах,. соответственно равных0,05 и 0,3 вес,% от среды.са, 4 Контроль (среда с 2% семипалатинского пептона) ОС 8 100+ 1 2+1 Ку куруз ный экс тра к т 1% Кукурузный экстракт,3% 2 Тунгопептон 2 50+ Исходная среда + дэкстракт 0,01% о 05% 1921 2 2451 3 О+ Исходная среда + кислотныйэкстракт "Витамин В, кормовой 0,075% 02+ 100+ 0 1 г 130 3 1 1010125Изобретение относится к получению Цель изобретения - повышение активферментов, в частности внеклеточной ще. ности рибонуклеазы в культуральной жид лочной рибонуклеазы микробиологическим кости и выхода целевого продукта,путем, и может найти применение в меди- Поставленная цель достигается тем,цине, пищевой промышленности и производ- что согласно способу получения внекле,стве реактивов для молекулярной биоло- точной щелочной рибонуклеазы ЬосИо 5гии и биоорганической химии, пФгпОдп 1 р включающий глубинноеИзвестен штамм ВбсИ 05 юМгпид 1 п 5 культвирование продуцента на питательЧР продуцент щелочной внеклеточной ри-, ной среде содержащей источники углерода,бонуклеазы, обладающий активностью 16 азота, минеральные соли, биостимулятор,2000-2500 ед, полученной культивиро- коагуляцию биомассы и кислых белковванием продуцента на среде определенно- подкислением до рН 2,6-3,0, осаждениего состава, белка сульфатом аммония и фракционироРибонуклеазная активность в заводс- вание фермента,на фосфоцеллюлозе, в каких условиях после 20 ч культивированиячестве биостимулятора используют дрож 10000 ед, 1, жевой экстракт или кислотный экстрактИзвестен способ получения гудогенной продукта "Витамин В. кормовой" в колищелочной внеклеточной рибонуклеазы Вас%-,чествах, соответственно равных 0,05 иЬЛ МеГФРдоь 1 р включающий глубин- О,З вес.% от среды,ное культивирование продуцента на сре- ц Сущность изобретения состоит в том,де, содержащей источник углерода - глю- что из перечня известных биостимулятокозу источник азота - пелтон и минераль- ров биосинтеза ферментов установленоные соли, коагуляцию биомассы и кислых, опытным путем что единственными длябелков подкислением до рН 2,5-3,0, осаж- данного продуцента, повышающими. активдение белка сульфатом аммония при рНность щелочной внеклеточной рибонук 85 фракционирование фермента на катио- леазыявляются дрожжевой экстракт и,ките, например, карбоксиметилцеллючо- . кислотный экстракт витамина В 2 кормозе 2вого в строго установленных количествах,Однако выход препарата фермента явля- В табл. 1 показана зависимость активется недостаточно высоким и составляетности РНКазы и выхода биомассь от раз 6-7 мг на литр культуральной жидкости. личньх биостимуляторов,Таблица 11010125 Продолжение табл, 1 142+ 3 150+ 2 144+ 1 0,3%0 35% 135+ 4 Как видно из табл. 1 использованиекукурузного экстракта, который являетсякомплексным источником органическогоазота, витаминов, минеральных элементов15тов и пр, и широко используется дляинтенсификации процессов в кимробиологической промышленности, а также тунгопеп тона - пеп тона растительного и роисхождения - приводит к увеличениюурожая биомассы более чем в два раза,20но резко снижает количество РНКазы вкультуральной жидкости, И тоьлко введение дрожжевого экстракта и кислотногоэкс тракта ви тами на В кормового (ГОСТ18666-73) в указанных концентрациях25(0,05 и 0,3 вес,% соответственно) приводит к увеличению количества РНКазыв культуральной жидкости на 33-44%,П р и м е р 1, В 150-литровыйферментер загружают 100 л среды сле- Зодующего состава, %: глюкоза 1,0; пептон 2,0; СаСР 2 0,01; И 50, 7 Н 200,03; ИаСГ 0,3; Мп 504. 0,01, рН 8,3(до стерилизации),Среду засевают 24- часовым инокулятом (1%) полученным при выращивании8 ас 1 Ицы 1 пСегтоЕЖп 7 р на среде тогоже сос тава. Процесс ферментации веде тся в течение 24 ч при 29 оС, Выделениеи очистку фермента ведут известным спо- фОсобом, Результаты представлены в табл.2. Таблица 100,0 36 10 1,3 10 3 100 3,6 Культурная жидкость 101,0 35.103 103 99 3,5 13 10 1,3 10 94 З,С 26,0 фильтрат после подкисления и удаления осадка Концентрат 1 (концентрирование на ротационномо испарителе при 37 С) П р и м е р 2. Культивирование иочистку фермента ведут аналогично примеру 1 с добавлением в среду 0,05 вес.%дрожжевого экстракта, Результаты представлены в табл, 3,П р и м е р 3 Культивирование иочистку фермента ведут аналогично при -меру 1 с добавлением в среду 0,3 вес.%кислотного гидролизата витамина Вкормового, Результаты представлены в табл,4,При культивировании Вас 1 Ииз 1 пСегтеа 1 п 5 1 р на средах с добавлением биостимуляторов наблюдается увеличение урожая клеток на 90% при добавлении в сре,ду дрожжевого экстрата и на 50% придобавлении в среду кислотного экстрактавитамина Вкормового, что приводит кповышению концентрации рибонуклеазы всреде на 30-40% или до 48-58 мг/л против 32-38 мг/л в контроле (пример 1).При более высокой активности рибонуклеазы в культуральной жидкости процесспоследующей очистки фермента происходитэффективнее, с меньшими потерями и выход готового продукта увеличивается в2 раза,В табл. 2 представлены результаты выделения и очистки .рибонуклеазы при культивировании Вас. 1 МегпЕйпЭ 1 р на контрольной среле (пример 1 ).1010125 Продолжение табл. 2 Сульфат-аммониййаяфракция (САф) 1 г 10 4,о 1 о2,О 4,5 4,9.10 39 10 ф Диализат САФ гз 104 94 10 7,3 47 1,7 53,104 9 5,103 3,О 43 1,6 Лиофилизирова нный продукт 1 130,0 1210 9510 42 1,5 После хроматографии нафосфоцеллюлозе Яесва 1" 4,0 27 104 2,6 1 о 5 30 1,1 0,3 Йиализат 6 0,6 Концентрата(см, концентрат 1 ) 75 10 7,2 10 0,09 18 067 Диофилизированныйпродукт 7,0 10 170,65 4 ОВ табл. 3 показано выделение и очист п 1 Егвийо 1 р на среде, содержащей дрожка рибонуклеазы при культивировании Вос, жевой экстракт (пример 2). Таблица 3 1,8 Культурная жидкость 100,48. 0 фильтра ления и осле подкисаления осадка 100,0 1,7,10 5 15 1 Оф 28 8 После хроматографии наИЭА Э-целлкаозеМмосй" Концентратй(см. концентрат 1 ), После рехроматографии на фосфоцеллюпозе фр.Концентрат 1 (концент:рирование на ротационном испарителе при37 С) 32 107 1 105 12105 7,21 о 5 0,65 1 10 ед./мг1010125 фракция (СА 22 10 8 4;6 70 1 ат Восле хроматографина ДЭАЭ-целлклозе,9 10 После рехроматографина фосфоцеллклозе"ФсА глап ф 5 1 0 10 изат 11 0,62 10 0 Концентрат И (см, конентрат 1 ) О 10 0 10 5 Лиофилизированныйдукт П 25 1 2 7,2 1 г В табл. 4 показано выделение и очистка рибонуклеазы при культивировании Вас 1 Мл,им-д и 4 .1 р Куль турал ьная,0 1,8 ь Фильтрат после подкния и удаления осадка 1,8. 10 97 0 50 5,0 1,8 10 16 10 0 4,8 Концентрат ование на спари теле концентриационном 37 С) 3, ОЗ 4.10 З на среде, содстракт витамимер 3),; 1010125 Сульфа аммонийная фракция (САФ) 2,0 4,4 диализат САф 3,7 5,0 42 104 4 104 3,4 8,0 Концентрат Й (см, концентрат 1 ) 16,105 1 4,104 3,2 2,0 Лиофилизированный продукт 1 26 10 1,5104 60ед/мг 3,1 1 20,0 55" 104 4,010 53 5,0 2,3 0,25 Диапизат 1,4 0,5 Концентрат Й 1 (см, концентрат 1) 13 101 71 10 26 1,3 52 0,1 Лиофилизированный продукт Й 7,1 10 26 1 10 о ед/мг 1,352 1,352 Составитель И, ПриваловаРедактор Л 1. Петрова Техред Л 1. Коштура Корректор М. Шароши Заказ 2408/3 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Л 1 осква, Ж, Раушская наб, д, 4/5"и е" После хроматографиина фосфоцеллюлоаеф РщдЦ" После рехроматографиина фосфоцеллкиозефЮаФ,пю в" 22 10 3,6 10 З, 84 72104 7,510 70 91 10 7,1 10 44 2810 7,110 27