Способ определения целостности клеточных мембран микроорганизмов

(2 (2 (4 ым заня 74,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ 1) 3249309/30-152) 12.02,81б) 07,04.83. Бюл. Мф 13 (72) С.ф. Савельев и Л.М. Алексин (71) Всесоюзный научно-исследователь ский институт особо чистых биопрепаратов.(56) 1, Кеар 1 е 1 Вау В. - "СгуоЬо 1 оцу", 1978, 15, й 5, р, 378-381.2, Биомембраны, Структура, функци методы исследования. Под,ред. М,Е, Б кера и Г.Я. Дубура, Рига, "Зинатнте" 1977, с. 10-15,Руководство к лабораторн тиям по цитологии. М., МВА, 19 с, 92. ТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМ включающий обраб флуорохромом, от пензии клеток от ние интенсивност симуме спектра, с я тем, что, с ности, одновреме определяют интен яния, а в качест пользуют примули целостность мемб ношения интенсив интенсивности св ПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСРАН МИКРООРГАНИЗМОВ, тку суспензии клеток ывание окрашенной сус флуорохрома и измерефлуоресценции. в макт л и ч а ю щ и й целью повышения точно с флуоресценцией ивность светорассее флуорохрома испричем оценивают ан по изменению отости флуоресценции к торассеяния1010126 1Изобретение относится к областимикробиологии.Известен микробиологический спо-соб оценки клеточных мембран заключающийся в том, что микроорганизмыпараллельно высеваются на полныйагар и на селективную питательнуюсреду, содержащую дезоксихолат натрия, на которой клетки, имеющие повреждение поверхностных структур, не вспособны к размножению, Через суткироста определяется процент поврежденных клеток путем подсчета числа колоний на чашках 1 1 1.Однако этот способ характеризует"ся длительностью, трудоемкостью и небольшой точностью. Кроме топв он непозволяет оценить степень поврежденности поверхностных структур, а выявляет лишь те повреждения, которыегубительны для бактерий, растущих населективной питательной среде с дезоксихолатом натрия.Известен также биохимический методопределения состояния клеточных мембран, включающий использование сложныхпрепаративных методов 2 ,Наиболее близким к йредлагаемомуявляется способ люминесцентного спектрального анализа клеток, включающийобработку суспензии клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензииклеток от флуорохрома и измерение интенсивности флуоресценции в максимуме спектра 1 3 1,Однако данный способ недостаточноточен и не дает четкой количественнойхарактеристики целостности мембран,1 Целью изобретения является повышение точности. 4 ОТаблиц а 1 Время куль 0 ч тивирова 1 ч Й 5 мин 2 ч 50 мин 3 ч 50 мин 4 ч 50 ми 50 мин 0,68+00 2+0,0 0,55+0,03 ия изменения целостпри стрессе клетки на азе роста бактериальподвергались термошоку ерений приведены в Таблица 2 Для выявле ности мембран стационарной ной популяции Результаты из табл. 2.В табл. 2 пени поврежде 8010 мин слсвия ОС 60 С,10 мин риведено изменение стности клеточных мембошока0,5+003 8,5+О,ран после терм Р, отн,ед. 0,95.0,03 1,15+0,0 Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определения целостности клеточных мембран микроорганизмов, включающему обработку сус.пензий клеток флуорохромом, отмывание окрашенной суспензии клеток отфлуорохрома и измерение интенсивностифлуоресценции в максимуме спектра,одновременно с флуоресценцией определяют интенсивность светорассеяния,а в качестве флуорохрома используютпримулин, причем оценивают целостность мембран по изменению отношения интенсивности флуоресценции к интенсивности светорассеяния,П р и м е р, Измерения целостности мембраны проводились в процессекультивирования Е,со 11 И. Пробыразводили физиологическим растворомдо концентрации 5 10клеток/мл.К 5 мл суспензии добавляли 0,1 млраствора приледпина С = 5 мг/мл).Через 10 мин инкубации клетки дважды отмывались центрифугированием при3500в течение 5 мин, затем ресуспензировались в том же количествефизиологического раствора. Интенсивность флуоресценции полученной суспензии окрашенных клеток измеряласьпри длине волны возбуждения й == 370 нм и длине волны регистрации-60 нм. Измеоение проводилосьна флуоресцентном спектрофотометреМРГ-Й (бирма Н 1 ТАСН 1, Япония), Одновременно на этом же приборе измерялась интенсивность светорассеянияпри " = 500 нм.,В табл. 1 приведено изменение целостности клеточных мембран во время культивирования Е. со 11 М( фактор Р ), 3 10101 б 4Таким образом, преимуществом поед- оценки целостности клеточных мембран лагаемого метода является возможность в нормальном состоянии микроорганизбыстрого получения количественной мов и после стрессовых воздействий, Составитель Р. Макаров Рейактор М. Петрова Техреду О.Неце Корректор М. Шароши Зкз гМР 1 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,