Способ получения целлюлаз

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК 5 Н 4 С 12 Я 9/42//(С С 12 К 1:885) 9/42,ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГКНТ СССР МИТЕТ ОТНРЫТИЯМ(53 (56 И 1 идетельство СССР 12 И 9/42, 1983. етельство СССР 12 Я 9/42, 1982. 1070161, к юлозы и лигнина соотношениях ц 3:2 до 13 и с лозы в среде 0 Изобретен техно тносит держании чистой целлю 65-1,35 мас.Х,. Эти исэы являются трудноприроде лигноцеллюлозм получе м г ибов способарование рбыть испольэовно-бумажной,ности и сельгии, в частност ия целлюлаз культив точники целлюл разрушаемыми в може родуцентов о в лесной екстильной целлюло ромышпе и и сельн) либо ромышленноми отходамиого хозяйств стве,зобретениболе могут быть полу богатых целлюло их частичного г ческими фрагмСпособ осущ яется повьпп в путемюлолити эой матер идролиза ц целлюла з, предусматри трудномета еллюлозы, п обработку с ие выходСпособ вает исп болиэиру рошедших удалени 1 ий саха нтеэа це ьз ент пс иср едва- легко ние тольк ствляют следую точников црительнуюметаболизиоптимальнь разом. В киспользуютБ 7 и 13/1 О,родуценто гша ч 1 гдй естве гЫо в, приюлаэ уемых Фрак для биоси штаммь ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(46) 07.07.89. Бюл, й. 25 (71) Институт биохимии им,А,Н,Бахафи Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) Е,С,Морозова, Л.И.Сажина, М,Л,Рабинович, А,С,Селиванов, А.М,Морозов, Т,И,Ширшова, А,А М,Л,Яковлева и Н,Н,Смертин(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано влесной, целлюлозно-бумажной, текстильной промышленности и сельскомхозяйстве, Цель изобретения - повышение выхода целлюлаз, Способ предусматривает выращивание продуцентаТгдсЬодегша ч 1 г 1 де на питательнойсреде, содержащей в качестве источника углерода лигноцеллюлозные видысырья, выбранные иэ отходов промышленности или сельского хозяйства,или твердый остаток этих отходов,подвергнутый обработке целлюлазами,причем Соотношение целлюлозы и лигнина устанавливают от 3:2 до 1:3, содержание чистой целлюлозы в средеот 0,65 до 1,35 мас,7, Выход целлюлаз повьппается в 1,4-4 раза, 1 э,п,ф-лы, 1 табл,В ид сырья Соотношени среде,7Средняя активность целлюпвэ,ед./мп Опыт 1 ШтаммРЧислоэкспеШтамм РЧисло экспериментов риментов лнгнин 12,7+4 16,012 ЗФ 1 1 13 2.1 1,1320,511 110, 13 19, ЗТЗ 1,1319,1+1 32 3:2 21,5 28,8 Т 7 22,5+5 1 т 0,351, 13 11 322+6 19+4 20,5 1+О, 131,3 1 тО, 13 33+2 1 О 19,9+О, 1 3 10, 13 1+О, 13 1:3 1:4 19,5+5 13,3+5 11 12 6,4 Ю,4 2 129220 1+0,13 4,6+0,2 1;4 13 13,5-2 30 жом П р и м е ч а и н е. 1 - сучковая целлюлоза производства лесопромышленного комплекса, 2 - холоцеллюлоза нэ стеблейхлопчатника (гуэапая); 3 - отход переработкибумаги н картона для текстильных патронов фабрики бумажно-техническнх иэделий; 4 - осажденныйбентоннтом нэ сточных вод отход производстваконденсаторной бумаги бумажной фабрики; 5 - кислотно-осахаренная древесно-волокнистая массапроизводства целлюлозно-бумвжного комбината;звездочкой обозначены вилы отходов после обработки целлюляэами (для снижения содержания целлюлозы). депонированные но Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов и имеющие соответственно регистрационные номера ВКПИ и Ри ВКПМ Р,Культуры продуцентон выращивают на скошенной агаризонанной среде Роулен-Тома н течение 5-6 сут, Ферментационная среда содержит н своем составе источник углерода н виде целлюлозосодержащего отхода, органический источник азота и необходимые минеральные соли, Ферментационную питательную среду засевают водной суспензией конидий со скошенного агара из расчета 1 О конидий/мл сре 6ды. Культивирование осуществляют н .колбах Эрленмейера объемом 750 мл при рабочем объеме среды 100 мп н условиях аэрации на круговых качалках, вращающихся со скоростью 200 Непровар (1) Холоцеллюлоза (2)Бумажнаяпыль (3) ХолоцеллюлозаБумажнаяпыльНепроварМелкое волокно (4)КОдВМ (5)БумажняяпыльМелкое волокноНепровар Мелкое волокноСвекловичный 491886220 об/мин, в течение 144- 192 ч при28-30 С.Активность целлюлолитических фер 5ментов определяют по степени гидролиза фильтровальной бумаги Ватман Ф 1,Количество образующихся редуцирующихсахаров определяют методом ШомодиНельсона, Целлюлолитическую активность выражают в миллиграммах глюкозы, образующейся н реакционной смесипри действии на субстрат 1 мл неразведенного фильтрата культуральнойжидкости (ед/мп), а также н между 15 народных единицах целлюлолитическойактивности (МЕ/мп).Таблица иллюстрирует средние достигаемые значения активности для различных видов лигноцеллюлозного сырья20 при реализации предлагаемого способана двух штаммах Т,ч 1 гойе, 14988Сопоставление данных таблицы показывает, что наиболее высокие выходы целлюлаз для обоих штаммов (в 1,5- 4 раза выше, чем для базового объекта, опыт 13) наблюдаются при использовании различных видов лигноцеллюлозных отходов или их остатков после обработки целлюлазами до достижения соотношения целлюлозы и лигнина от 3:2 до 1;3 (предпочтительно от 1 1 до 1:2), Как повьппение (опыты 1 и 2), так и понижение (опыты 11 и 12) этого соотношения приводит к ухудшению выхода ферментативной активности несмотря на то, что во всех случаях уравнивается содержание чистой целлюлозы в среде культивирования, Установлено, что при использовании приготовленных указанным вьппе способом лигноцеллюлоэных материалов в среде культивирования содержалось не свьппе 0,025 г/л растворимых сахаров, тогда как при использовании свекловичного жома их концентрация в среде составляла 1,8 г/л,П р и м е р 1 (контроль)Лля осуществления процесса биосинтеза целлюлолитических ферментов конидиямиштаммов Т,ч 1 г 1 де 13/10 или Б 7 засевают ферментационную среду следующего состава, мас,7:Свекловичный жом 4,0Пшеничные отруби 5,0КН Р 04 0,2МБО 4 0,06МН,С 1 0,6Солодовые ростки 1,43Вода - водопроводная, рН - натуральный,Культивирование осуществляют вколбах Эрленмейера объемом 750 млпри объеме среды 100 мл, Оптимальнаяотемпература ферментации 28-30 С. Через 144 ч уровни целлюлолитическойактивности составляют, ед,/мл (МЕ/мл):Штамм 13/ 10 (Г) 12,9 (1, 19)Штамм Б 7 (Г) 12,9 (1, 14)П р и м е р 2, Процесс ферментацииосуществляют в тех же условиях, чтои в примере 1, но вместо свекловичного жома используют обработаннуюцеллюлазами холоцеллюлоэу гуэапаипри соотношении целлюлозы и лигнина3:2 и содержании в среде чистой целлюлозы 1,13 мас.7, Через 168 ч уровни целлюлазной активности составляют,ед,/мл (МЕ/мл); 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Штамм 13/10 20,3 (1,9)Штамм Б 7 16,9 (1,65)П р и м е р 3. Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловичного жома используют мелкое волокно отход производства конденсаторной бумаги при соотношении целлюлозы и лигнина 1:1 и содержании чистой целлюлозы в среде 0,9 мас,Х для штамма 13/10 и 1,13 мас,7 для штамма Б 7, Через 192 ч уровни целлюлазной активности составляют, ед,/мл (МЕ/мл):Штамм 13/10 24,1 (2,2)Штамм Б 7 28,2 (2,6)П р и м е р 4, Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловично - го жома используют бумажную пыль (отход бумаги для текстильных патронов), обработанную целлюлазами при соотношении целлюлозы и лигнина 1:2 и содержании чистой целлюлозы в среде 0,9 мас.7. Через 168 ч уровень целлюлазной активности для штамма 13/ 1 О составляет 46, 1 ед,/мл или 4,3 МЕ/мл,П р и м е р 5. Процесс ферментации осуществляют в тех же условиях, что и в примере 1, но вместо свекловичного жома используют мелкое волокно отход производства конденсаторной бумаги - после обработки целлюлазами при соотношении целлюлозы и лигнина 1:3 и содержании чистой целлюлозы вЭсреде 1,13 мас,7. Через 192 ч уровень целлюлазной активности составляет, ед./мл (МЕ/мл):Штамм 13/ 10 25,5 (2,3)Штамм Б 7 20,0 (1,9)П р и м е р 6 (опытно-промышленные испытания), Ферментацию проводят в ферментере рабочим объемом 9 м на среде того же состава, чту и в примере 1, эа исключением того, что пшеничные отруби используют в концентрации 0,57, а вместо свекловичного жома в ферментер загружают 117 кг по сухому весу бумажной, пыли, предварительно обработанной целлюлаэами, при соотношении целлюлозы и лигнина 1 1 и содержании чистой целлюлозы в ферментере 0,65 мас,7. Посевной материал - 5 колб поверхностной культуры штамма Т,ч 1 г 1 се 13/10, Время активации на качалке 13,5 ч, Продолжительность выращивания посевного материала в инокуляторе 22,5 ч, объем инокулята 1 мз, исходный рН среды 5,25,1491886 чить в тех же условиях и эа то жевремя выход целлюпаэ в 1,7 раза вышепри использовании более дешевого,сырья - остатка ферментативного гидролиза бумажной пыпи,формула изобретения 2, Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что в качестве продуцента используют штамм ТгсЬодегша чгЫе ВКПМ Рили Тг 1 сЬодегша ч 1 гЫе ВКПМ Г,Составитель И,ПриваловаРедактор В.Петраш Техред Л.Сердюкова Корректор М,Васильева Заказ 3827/27 Тираж 500 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, улГагарина, 101 Через 121 ч уровень активности штамма13/10 22,6 ед,/мл или 2,1 МЕ/мп присреднегодовом уровне на среде с жомом (базовый объект) 13,2 ед./мл или1,2 МЕ/мл,В примерах 4-6, где используетсяобработка целлюлазами для полученияцеллолигнина необходимого состава,применятсй глубокий гидролиз ферментными препаратами целлобранином, целлокандином, целловиридином из расчета 20 ед,/г сырья в течение 48-72 чпри 45-50 С с последующим тщательнымотмыванием образующихся сахаров доконцентрации менее 0,0023, Обработанное ферментами сырье фактически можетявляться отходом ферментативного получения сахаров.Таким образом, предлагаемый способ 20позволяет повысить выход целлюлаз в1,5-4 раза, утилизировать трудноразрушаемые лигнифицированные отходыпромышленности и сельского хозяйстваи заменить кормовое сырье - свекловичный жом.За базовый объект принят способполучения целлюлаз, используемый набиохимическом заводе и включающийкультивирование продуцентов целлюлазгрибов Тгспойеппа л.г 1 йе (Т, геезе 1 )на среде того же состава, что в примере 6, за исключением того, что вкачестве источника углерода используется .4 Х-ный жом,По сравнению с базовым объектомпредлагаемый способ позволяет полу 1. Способ получения целлюлаз, предусматривающий культивирование грибовТг 1 с 11 одегша врр - продуцентов целлюлолитических ферментов на питательнойсреде, содержащей целлюлозосодержащийисточник углерода, источник аэота -пшеничные отруби и солодовые ростки,минеральные соли и воду при оптимальной температуре культивирования додостижения максимальной активности,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения выхода целлюлаз,в качестве источника углерода используют лигноцеллюлозные виды сырья,представляющие отходы промышпенностиили. сельского. хозяйства, или твердыйостаток этих отходов, подвергнутыйобработке целлюлаэами, при этом соотношение целлюлозы и лигнина устанавливают от Зф 2 до 1:3, содержание чистой целлюлозы в среде - от 0,65 до1,35 мас,7,