Способ получения олигодезокситионуклеотидов

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскияСоциалистическихРеспублик(22) Заявлено 30. 04. 81 (21) 3285636/23-04 М Ку 3 С 07 Н 21/04 С 01 0 33/68 с присоединением заявки Йо(23) ПриоритетГосударственный комитет СССР по дедам изобретений и открытийОпубликовано 07,12 В 2.Ьоллетень Йо 45 Дата опубликования описания 07.12. 82 фГ,.иИнститут цитологии и генетики Снбирского".отделения АН СССРщ м,(72) Авторы изобретения В.П.Кумарев, В.С.Богачев и В.Н,Рыбаков(73) Заявитель С 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯОЛИГОДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ О О 0где Втимин, аденин, гуанин, цитозин;1-14;водород или остаток Фосфотио ата.дезокситионуклеотиды Формулы ются биологически актиВными иями и используются в каатриц в РНК-полимераэной Е.соЕ 1,тен способ получения олиго" ионуклеотидов формулы С),Олиг С 3) явл соедине честве м системе Изве дезоксиИзобретение относится к усовер. шенствованному способу получения олигодезокситионуклеотидов общей формулытт 0 О В заключающийся в последовательной обработке литиевой соли 2-дезокси-Яацилнуклеозид Силн олиготионуклеоти"дил)-3 -фосфотиоатов мономером - ли 1тиевой солью 2 ф,5-дидезокси-Б"ацил 5 -йоднуклеоэид-ЯВ,Ю-дифенилкарбамонл-Силн циан)этилфосфотиоатовили 2,5 -дндезокси-В-ацил-йоднуклеоэидами в водном диметнлформамидеСДИФА) в осаздении продукта ацетоном,.осадок отделяют центрифугирова .нием, в обработке его щелочью, вэкстракции щелочного раствора толуолом с последующей нейтрализациейкатионообменной смолой, в Н+ -форме,во взаимодействии полученного продукта со следующим мономером, в обработке, в случае необходимости, кон О центрированный аммиаком и в выделении катионообменной хроматографиейдля получения целевого продукта,где В - водород. Додекадезокситионуклеотид состава ЙСОТССАТ 7) получен с выходами 86-95 на стадию, длительность реакции на одной стадии2,1 ч, длительность раСтворения реагентов 3,5 ч, средняя длительностьстадии 9,6 ч. Длительность. первойстадии 3 ч, десятой - 14 ч, что свя- ЗО эано с сильньач замедлением реакции979361 и ухудшением растворимости реагентов в ДМФА (, 1 .Недостатками этого способа являются низкая скорость взаимодействия реагентов, обусловленная недостаточно высокой реакционной способ ностью применяемых литиевых солей мономеров как йод-, так и фосфотиоатсодержащих; значительное замедление скорости реакции и связанное с этим увеличение затрат времени на 10 одну стадию по мере увеличения длины синтезируемого продукта; наличие воды в реакционной среде, приводящее также к уменьшению скорости реакции; плохая растворимость литиевых солей реагентов в диметилформамиде, вызывающая большие затраты времени на их растворение (необходимость перемешивания усложняет синтез); необходимость экстракции щелочного раствора толуолом для удаления дифенилакриламида; неоправданно сложное проведение ряда операций, а именно выделение осадка продукта центрифугированием и удаление воды лиофильной сушкой, что усложняет процесс.Целью изобретения является сокращение затрат времени при синтезе олигодезокситионуклеотидов и упрощение процесса.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения олигодезокситионуклеотидов формулы (1), заключающемуся в том, что проводят последовательную обработку тетрабутиламмонийной соли 2 -дезокси-Нацилнуклеозид (или олиготионуклеотидил)-3 -фосфотиоата внутренней солью 2,5 -дидезокси-Б-ацил-йоднукле(озид-ЯБ-( и-диэтилметиламино) 40 фенил 1 карбамоилэтилфосфотиоата общей ФормулыСН 5(18,8 мгу 0,02 ммоль) и 2 зокси-йод-Я 4-анизоилци 50 -я-Ь-и-(и-диэтилметилами карбамоилэтилфосфбтиоат ( 0,024 ммоль) растворяют в ном .диметилформамиде (0,6 держивают 2 мин. Затем см 55 рабатывают 0,05 М раствор го лития в ацетоне (20 мл отфильтровывают, промываю(2 5 мл), сушат в вакууме Осадок растворяют в 1 М Ь 60 выдерживают 25 мин и нано лонку, содержащую в нижне дауэкс 50 в Ви 4 Фформе (1 верхней - дауэкс 50 в пир форме (3 мл). Смолу элюир4-анизоилциВцИ ) соль ,5-дидетидинно)фенил9 мг;безводмл) и высь обм йодистоосадок ацетоном10 мин.ОН (2,0 мл),ят на кочастимл), а в диниевойуют водойаривают 0 0оф Ь-С Н-С2 0где В - тимин, И 4-анизоилцитозин,.И -бензоиладенин, И -изобу 2.тирилгуанин,реакцию осуществляют в безводномДМФА, продукт реакции осаждают раствором йодистого лития в ацетоне,(осадок Фильтруют), осадок обрабатывают щелочью, нейтрализацию щелочного гидролизата продукта проводят путем пропускания через колонку,содержащую в верхней части катионообменную смолу в пиридиниевой Форме,а в нижней части - в тетрабутиламмониевой форме. Полученный продукт подвергают взаимодействию со следующим мономером, обрабатывают, в случае необходимости, концентрированным аммиаком, и выделяют катионообменной хроматографией для получения целевого продукта, где В - водород. Схема реакции 1 г 0Уоф -в,где В - тимин, М -анизоилцитозин,И-бензоиладенин, Н -изобугтирилгуанин;В - Н, остаток фосфотиоатов;В - Н, олигодезокситионуклеотидил оС,НС 1 Н СН 1 (С Н, ) СНК"-(Н-С Н ) И+4 Р 4Средняя длительность реакции 0,08 ч,средняя длительность одной стадии1,3 ч. П р и м е р 1. 2 -Дезокси-Гцитидилил(3-5)-5 -дезокси-тио(цитидилилф Ф г(досуха и используют далее, не очищая, на второй стадии.Синтез на последующих стадиях 2-15 проводят аналогично стадии 1. Загрузка исходных веществ и времяреакции приведены в таблицеНа пятнадцатой стадии продукт,после осаждения ацетоном, растворяют в 10 мл концентрированного раствора аммиака в воде (осч), выдерживают б ч при 50 С, упаривают аммиак и наносят на колонку с амино хромом С(75 см). Элюируют 0,08 М К Н Р 04, рН 6,5 (0,5 л), в 9 М мочевине, затем линейным градиентом 0,08+0,11 К НР 04 в 9 М мочевине (рН 6,5), объем смесителя и резервуара по 1 л, скорость элюации 90 мл/ч. Продукт выходит при 0,105 М КНР 04 . Соответствующие ему фракции промеряют на спектрофотометре, объединяют, разбавляют в 2 раза водой и наносят на 1 мл аминохрома С. Промывают водой, 0,2- 0,4 М бикарбонатом аммония (40 мл), рН 7,0 и затем элюируют продукт 3 мл 1 М бикарбоната аммония (рН 8,5) . Раствор упаривают в вакууме и водный раствор окончательно очищают на колонке с сефадексом С(100 мл), элюируя продукт водой. Фракции, соответствующие пику продукта, пропускают через катионит челекс (Наформа, 1 мл), упаривают и растворяют в 0,3 мл воды. К этому раствору прибавляют ацетон (10 мл), осадок продукта центрифугируют, сушат в вакууме и получают 17 мг (16 в расчете на исходный мономер) пентадека натри- евой соли (П). Структуру продукта подтверждают модифицированным методом Сэнжера, подвергая электрофорезу на ацетате целлюлозе его фосфодиэстерозный гидролизат, споследующей гомохроматографией на ТЭАЭ-целлюло.зе при .30 и в присутствии меркаптоэтанола, идентификация пятен гомохроматограммы дает структуру С-С-А-Т-С-С-Т - Т-Т-С-С-А-Т-Т-Т-О,П р и м е р 2. 2-Дезокси(цитидилил-(3- 5)-5 -дезокси-тиоцитидин-Фосфотиоат, 2-дезокси-В 4-аниэоилцитидин-фосфотиоат, ди-(Вц 4 М )- + соль (18,8 мг; 0,02 ммоль) и 2,5 - дидезокси-Н 4-анизоил-йодцитидин -Я-Ь-И-(и-диэтилметиламино) фенилкарбамоилэтилфосфотиоат (19 мг, 0,024 ммоль) растворяют в безводном диметилформамиде (0,6 мл) и выдерживают 2 мин. (20 мл), осадок отФильтровывают, промывают ацетоном (215 мл), сушат в вакууме 10 мин. Осадок растворяют в концентрированном аммиаке, выдерживают б ч при50 фС, упаривают досуха и наносят раствор в 0,1 М бикарбонате аммония,рН 7,5, в 10-ном спирте (1 мл) наколонку, содержащую 200 мл сефадекса С = 25 суперфайн в.том же буфере при 5 С. Элюцию проводят тем жебуфером со скоростью 5 мл/ч, Фракции,соответствующие пику продукта, объе диняют, упаривают в вакууме, затемтрижды с 70-ным спиртом, водныйраствор пропускают через катионитчелекс (Ма-форма), упаривают досуха и раствор в МеОН (0,3 мл) выли вают в эфир (20 мл), осадок отфильтровывают и получают 0,065 г (94)тринатриевой соли (П). Вещество гомогенно при ионообменной и гельхроматографии, а также при тех на силуфолев системе хлороформ - метанол Мацетат аммония (рН 6,5) (10:20:2 ч/ч),Уф-максимум в воде 272 нм (Я=18200)ууф-минимум 248 нм ( = 12000), содержание тиофосфатных групп 99 по данным йодометрического титрования, чтоподтверждает структуру ц .ЮИспользование предлагаемого спасо"ба получения олигодезокситионуклеотидов обеспечивает по сравнению с известными следующие преимущества:сокращение длительности одной стадиивсреднем с 9,6 до 1,3 ч или в 7,4раза за счет увеличения скоростивзаимодействия реагентов в среднем в 25 раз - 2 ч экономии; уве личение скорости растворения реагентов в среднем в 100 раз - 3,5 чэкономии; исключение экстракций толуолом и фильтрование катионообменной смолы - 0,3 ч экономии; замена 40 центрифугирования и лиофильной сушки на менее длительные и более простые фильтрование и упаривание наротационном испарителе - 2,5 ч экономии;45 упрощение процесса, заключающееся в исключении механического пере"мешивания при растворении реагентовза счет применения хорошо растворимых солей последних; упрощении опе 5 ф рации щелочного гидролиза за счетприменения для нейтрализации щелочи избытка катионита в пиридиниевойформе и проведения ее в колоночномрежиме.55 Скорость взаимодействия реагентовв предлагаемом способе увеличивается в 10 раз по сравнению с начальнойстадией прототипа, но вследствие существенного замедления ее на конеч ных стадиях в последнем скорость реакции увеличивается в среднем в 25 раз.979361 Длительность реакции, мин Стадии Реагирующие вещества,АИ с Аи еаСРз, (ВцН+) (20) + 1 аСРвКт (24) Продукт .стадии 8;М%я 2, 5 -Дидеэокси-йод-тимидин-8-)Ъ-И-( и-диэтилметил 1 амино) фенил карбамоилэтиуфосфотиоат. ф . 2,5 -Дидезоксийод-К -изобутирилгуанозин, нуклеотидов общей Формулы"ио фЯО Ооф Э Формула изобретения Способ получения олигодезокситио-3-Фосфотиоата мономером в диметилформамиде, в осаждении продукта, вобработке его щелочью с последующей 4 ф нейтралиЬацией щелочного гидролизакатионообменной смолой, во взаимодействии полученного продукта соследующим мономером,.в обработке, вслучае необходимости, концентриро- И ванным аммиаком и выделении катионоЗаказ 9270/2 Тираж 388 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по,целам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная, 4 обменной хроматографией для получения целевого продукта, где В - водород, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,.с целью сокращения длительности про.цесса и его упрощения, в качестве соли 2-дезокси-Н-ацилнклеозид(или олиготионуклеотидил -3-фосфотиоата используют их тетрабутиламмонийную соль, в качестве.мономера применяют внутреннюю соль 1,5-дидеэокси- .-Н-.ацил-йоднуклеоэид-8Б-(идиэтилметиламино)фенил 3 карбамоил этилфосфотиоата общей формулы 61 10где В - тимин, Нанизоилцитоэин,Иф-бенэоиладенин, Б -изобутирилгуанин,реакцию проводят в безводном диметилформамиде, продукт реакции осаждают раствором йодистого лития вацетоне, а нейтрализацию щелочногогидролиэата продукта проводят путемпропускания через, колонку, содержащумв верхней части катионообменную смолу в пиридиниевой форме, а в нижнейчасти - в тетрабутиламмонийной фор-ме. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРпо заявке Р 2798760/04,кл. С 07 Н 19/06, 1979 (прото- .тип).