Способ получения продуктов ферментативных реакций

(23) ПриоритетОпубликовано 30.08,7 Государственный комите Совета Министров СССпо делам изобретенийи открытий Бюллетень32 3) УДК 577.15,0) Заявитель й химии и химии воды АН Украинской СС 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ фЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙИзобретение относится к области биохимической технологии и представляет собой усовершенствованный способ получения продуктов ферментативных реакций в биохимических реакторах.Предлагаемый способ может быть использован на предприятиях пищевой, медицинской и микробиологической промышленности а также при очистке сточных вод на промышленных предприятиях.В современной биохимической технологии находят все более широкое применение ферментативные процессы. В последнее время для их осуществления используют иммобилизованные ферменты.Известные до настоящего времени способы получения препаратов иммобилизованных ферментов предусматривают предварительное получение закрепленных на носителе или в порах носителя ферментов, которое часто сопровождается заметным снижением активности закрепленных ферментов, требует проведения трудоемких технологических операций, очищенных ферментов, дорогих и дефицитных реактивов, используемых для связывания ферментов.Известный способ предусматривает проведение ферментативных реакций путем контактирования ферментов с нерастворимым в воде и не вызывающим денатурации белка носителем и пропускание через эту систему раствора или суспензии субстрата, причем в качестве носителя используют полимерыполиэтилен, поликапролактам, полиуретан и дру гие, поверхность которых предварительно обрабатывают химическими реагентами, содержащими нитрильные, амидные илп уреидные группы, способствующие адсорбцпн фермента.Недостатками известного способа проведе ния ферментативных реакций являются;недостаточно высокая интенсивность ферментивных реакций из-за незначительной адсорбционной емкости носителя;загрязнение конечного продукта реакции вы носимыми из носителя ферментами и продуктами обмена развивающихся в реакторе микроорганизмов, так как ферментатпвные реакции проходят при температурных оптимальных для развития многих микроорганизмов, а 2 Э ферменты - белки представляют собой отличную питательную среду для нпх;ограниченный арсенал носителей, которыйвкспочает в себя только лишь некоторые полимеры (полиэтилен, поликапролактам, по лиуретан), которые, к тому же, требуют специальной подготовки поверхности химическими реактивами, способствующими адсорбцпп фермента.Предлагаемый способ проведения ферменЗд тативных реакций проведения позволяет расширить ассортимент носителей, а также способствует интенсификации процесса ферментации и улучшения качества конечных продуктов и заключается в том, что операции контактирования ферментов с носителем и пропускания через эту систему раствора или суспензии субстракта осуществляют в электрическом поле постоянного тока напряженностью 5 - 300 в/см.Контактирование ферментсодержащего препарата с носителем в электрическом поле приводит к повышенной и регулируемой напряженностью электрического поля сорбции фермента на носителе. При этом количество адсорбированного фермента может в сотни и тысячи раз превышать адсорбционную емкость носителя по ферменту вне электрического поля, Это обеспечивает интенсификацию процесса ферментации, позволяет увеличить скорость пропускания субстрата, Количество адсорбированного фермента и прочность удерживания его носителем можно регулировать с помощью напряженности электрического поля. Каталитическая активность фермента в электрическом поле не уменьшается. Установлено также, что наложение электрического поля на заполненный носителем обьем подавляет развитие в этом объеме микроорганизмов и даже действует бактерицидно, Предотвращение размножения микроорганизмов в объеме загрузки исключает снижение интенсивности ферментативного процесса за счет потребления микроорганизмами белков-ферментов в качестве источников питания. Использование неорганических материалов в качестве носителя также устраняет возможность их микробного разрушения. Все это предотвращает загрязнение конечного продукта микробными метаболитами.В отличие от известного способа, в котором в качестве носителя ферментов используются синтетические полимеры вполне определенного строения, по предлагаемому способу носителем ферментов может служить любой зернистый, волокнистый и (или) пористый материал, не вызывающий денатурации фермента - белка, выбранный из группы диэлектриков, например силикагель, песок, глинистые материалы, природные и синтетические полимеры, и проводников 11 рода, например, ионообменные смолы.Для проведения ферментативной реакции по предлагаемому способу можно пользоваться ферментными препаратами различной степени очистки - от кристаллических до технических, что значительно расширяет возможности осуществления таких реакций, делает их дешевыми и доступными, Стоимость предлагаемого способа проведения ферментативных реакций выразится в расходе электроэнергии, который в случае проведения реакции в обессоленной воде крайне незначителен.При использовании низких напряженностей электрического поля (меньше 10 в/см) 5 юо 15 2 з 2 з 35 40 45 50 55 бО 65 снижается степень удерживания фермента в объеме загрузки, а при высоких напряженностях (более 300 в/см) может происходить существенное нагревание загрузки, что ведет к денатурации белка и потере ферментативной активности.При необходимости ферментные процессы могут быть прерваны на некоторое время, например на ночь, выходные дни, прекращением подачи субстрата и выключением электрического тока. Для возобновления ферментации включают ток и обеспечивают подачу субстрата.Ферментативная реакция по предлагаемому способу может быть осуществлена в простом аппарате, изготовление которого не представляет трудности для любого предприятия.Использование предлагаемого способа проведения ферментативных реакций имеет по сравнению с известными способами следующие преимущества:увеличение скорости ферментативных реакций за счет увеличения количества адсорбированного на носителе фермента;использование самых разнообразных материалов в качестве носителей без предварительной обработки их поверхности;получение конечных продуктов ферментативной реакции высокого качества, без примесей белков и продуктов обмена микроорганизмов;применение иммобилизации и проведения ферментативных реакций не только высоко- очищенных, кристаллических ферментов, но и технических ферментативных препаратов.П р и м е р 1. В среднюю камеру трехкамерной ячейки размером 25 Х 37 мм (длина - ширина - высота) загружают носитель-вату - и отделяют от электродных камер целлофановыми мембранами. Электродные камеры заполняют активированным углем и обеспечивают проток дистиллированной воды, Через среднюю камеру при наложенном электрическом поле (напряженность 200 в/см) пропускают раствор кристаллической бактериальной амилазы (производство японской фирмы Палача Казе 1 К. К.) со скоростью 1,2 мл/мин. При этом амилаза закрепляется на носителе - вате. Затем через загрузкус носителем и сконцентрированным на нем таким образом ферментом пропускают 1 %-ный раствор крахмала со скоростью 1,2 мл/мин. Из загрузки вытекает раствор, содержащий глюкозу,Одной загрузкой фермента можно осуществлять гидролиз (даже с перерывами в ночные смены и выходные дни) в течение нескольких недель.Спектрофотометрический анализ, вытекающий после ферментативного процесса жидкости, указывает на отсутствие в ней фермента.П р и м е р 2. Силикагель марки КСМзагружают в среднюю камеру ячейки, описанной в примере 1, и пропускают через эту загрузку526623 Составитель А. Бочаров Редактор Т, Никольская Текред А, Камышникова Корректор А, Дзесова Заказ 1827/1 Изд.1554 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 51,5%-ный водный раствор очищенного амилолитического препарата из гриба Азрегр 11 цз огу 1 ае 47 б и при напряженности электрического поля постоянного тока 150 в/см со скоростью 0,9 мл/мин. Через среднюю камеру при включенном электрическом поле пропускают 0,1/о-ный раствор глюкофрангулина с такой же скоростью протока.Бумажнохроматографический анализ - (система бутанол - уксусная кислота - вода 4: 1: 5) вытекающей из камеры жидкости указывает на наличие в ней продукта ферментативной реакции - франгулина и отсутствие исходного глюкофрангулина. Белок в вытекающсй жидкости не обнаруживается с помощью ультрафиолетового спектрсфотометра Ьресогд 7 Ч И 5.П р и м е р 3, Через среднюю камеру ячейки, описанной в примере 1 и загруженной смесью анионообменной (АБ) и катино- обменной (КУ) смол (в соотношении 1,4: 1) при включенном электрическом поле напряженностью 10 в/см пропускают 0,7% ный водный раствор грибной целлюлазы, а потом 0,1% -ный раствор карбоксиметилцеллюлозы со скоростью 0,2 мл/мин, В вытекающем из загрузки растворе с помощью химических реакций обнаруживается глюкоза: фермент из загрузки не вымывается.П р и м е р 4. Через среднюю камеру ячейки, списанной в примере 1 и загруженной 750 г ваты, при наложенном электрическом поле напряженностью 50 в/см пропускают 1,5%-ный водный раствор очищенного ферментатного препарата Ораза из гриба Азрегр 11 цз огузае 47 б И, а затем 0,05/о-ный раствор стероидного сердечного глюкозида к-строфантин-р со скоростью 0,1 мл/мин, Хроматографический анализ вытекающей жидкости показываетналичие в ней сердечного глюкозида цимарина, что свидетельствует о ферментативнойтрансформации исходного продукта, Спект 5 рофотометрически подтверждается отсутствиефермента в вытекающей жидкости.П р и м е р 5. Среднюю камеру трехкамерной ячейки, описанной в примере 1, размером50 Х 8 р,115 мм (длина - ширина - высота)10 загружают отмытым песком и прп включенном электрическом поле напряженностью200 в/см пропускают 1%-ный водный растворочищенного а мил олитического ферментногопрепарата из гриба Азрегр 11 цз огузае 476 И,15 а затем 1/о-ный раствор крахмала со скоростью 1,0 мл/мин. В вытекающей из загрузкижидкости содержится глюкоза,Формула изобретения20 1. Способ получения продуктов ферментативных реакций, включающий контактирование ферментов с нерастворимым в воде и невызывающим денатурации белка носителеми пропускание через эту систему раствора или25 суспензии субстрата, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью интенсификации процесса ферментации и улучшения качества конечногопродукта, контактирование ферментов с носителем и пропускание через эту систему раст 30 вора или суспензии субстрата осуществляютв электрическом поле,2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что процесс ведут в электрическом поле постоянного тока напряженностью 5 - 300 в/см.35 3. Способ по п. 1, отличающийся тем,что в качестве носителя применяют природный или синтетический полимер, напримервату.