Способ определения фракционного состава растворимых белков кожи

. К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоввтсимаСоцмалмстмчвс имирве л 1 тблни(5 )М. Кл,С 01 Н 33/48 0 01 й 27/26 3 Ьеударстванак квинтет СССР ае аваен иэоеретенке и ютврытийОпубликовано 23,09,82, БюллетеньДата опубликования описания 23.09.82 ллов, И.С.Старостина, Н.И.Иакарев и Е.К.Богданова) Авторы, изобретен Хабаровскии научно-исследовательскии инсэпидемиологии и микробиологии и Хабаровсгосударственный медицинский институт аявите(54) .СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА РАСТВОРИИЫХ БЕЛКОВ КОЖИ ение продолжительно екаи с о есса ковстраечек е ь озвод бел- ти 20Кроме топодвергаютжанне белка600-1000 нг ке раЦе больш более ций) аиел 1 Изобретение относится к медицине в частности к способам исследованияожи. Известен способ определения ионного состава расторимых бе ожи путем ее гомогенизации., э гирования фосфатным буфером в ние 1 сут и ц ентри фу ги рова ни я ледующим разделением белковых ий в,супернатанте методом дис лектрофореза в полиакриламидн е, Способ дает возможность вы-8 белковых фракций в нормаль до 18 фракций в патологическ оже 11. Однако известный способ не яет получить более полного пр тавления о спектре растворимы ов кожи, что важно при диагно зличных патологий кожи. ль изобретения - выявлени его числа фракций, т.е. н полного состава (25-29 ф растворимых белков кожи .чпр цУказанная цель достигается способом определения фракционного состава растворимых белков кожи, включающим гомогенизацию пробы, экс" тракцию белков и центрифугирование с последующим разделением белковых фракций в супернатанте методом дискФэлектрофореза в полиакриламидном геле, согласно которому гомогенизацию пробы ткани проводят одновременно с экстракцией в присутствии кварцевого песка и физиологического раствора в соотношении 2: 1:4 в те. чение 20-25 мин, а центрифугирование осущестрляют в течение 40-45 мин при 8000 об/мин. о, диск-электрофорезу робу супернатанта, содв которой составляетТабли ца 1 Пробы - образцы Содержание белка 2 неразведенном супертанте, г,29 4360 429 46 820 180 40 18 2400 600 80 Э 9Процесс обработки пробы и выявление Фракционного состава белков ведут на холоду (0-4 С)Разделение белков кожи на фракциипроводится известным методом в ПААГ1 21, но в подготовку пробы белковкожи (экстракта белков кожи) внесено ряд существенных изменений, влияющих на конечные результаты этого известного метода,Для полуумения экстракта (или супернатанта) в достаточном количестве для исследования с нужным содержанием белков (не менее 4-54)необходимо растирать ткань с квар.цевым песком и Физиологическим раствором в определенном соотношениио2:1:4 в течение 20-25 мин при 0-4 С,При растирании ткани менее 20 мингомогенизат неоднороден и с .низкимсодержанием белков, При более длительном растирании на старте гелеФореграммы появляется денатурируемый белок.Важную роль для получения положительного эффекта оказывает прием центрифугирования гомогенизата.Наилучшим вариантом является центрифугирование при 8000 об/мин в течение 40-45 мин.При меньших оборотах центрифуги неуспевает Формироваться плотный осадок,. в результате чего супернатант мутный,что мешает его дальнейшему исследоваВ 01, мл неразведенногосупернатанта, нг В 01, мл супернатанта, разведенного физраствором, нг В 0,1 мл супернатантаразведенного Физраствром и крупнопористымгелем, нг 60625 фнию. При более продолжительном временицентрифугирования появляется денатурированный белок на старте.Одним из основных условий наи лучшего выявления различных белковых фракций является достаточноесодержание белков в исследуемой пробе,Оптимальным содержанием белковв пробе является 600- 1000 нг. При1 р более низкой концентрации снижается количество выявляемых фракций,а при более высоком содержании затрудняется разделение белковых фракций.П р и м е р. К 0,5 г охлажденнойкожи человека, взятой послойно (эпидермис, дерма.и цельная кожа) навсю толщину электродерматомом улиц, подвергшихся оперированию (эппендэктомия, грыжесечение), предварительно отмытой физиологическимраствором от крови, измельченной ипомещенной в фарфоровую ступку, добавляют 0,25 г кварцевого песка и2 мп охлажденного физиологическогораствора и гомогенизируют на холодуо(0-4 С) в течение 20 мин, послечего гомогенизат количественно переносят в центрифужные пробирки ицентрифугируют при 8000 об/мин втечение 40 мин. В полученном супернатанте определяют содержание белка по методу Лоури.Содержание белка в различных пробах-образцах приведено в табл. 1.Белковые зоны Пробы-образцы кожи (К) 1 1 1 пристартовая 0,02 0,02 0,02 0,03 0,03 0,03 0,06 0,06 0,06 0,06 П пристартовая 0,09 0,09 0,09 0,09 Медленные пострансФеррины 0,12 0,12 0,12 0,15 0,18 0,15 0,18 0,18 0,21 0,21 0,21 0,26 0,26 0,32 0,44 0,44 0,53 0,54 0,67 0,67 0,67 5 9606Исходя из количественного содержания белков в супернатанте разводят его Физиологическим раствором (табл. 1) с таким расчетом, что в о,1 мл раствора содержится 1800-2400 нг з белка. Затем смешивают разведенный супернатант с раствором крупнопористого геля в соотношении 1:3 (к 0,1 мл разведенного супернатанта 0,.3- мл крупнопористого геля), после чего О в 0,1 нг смеси содержится 600- 1000 нг белков (табл., 1). Это количество наносят на трубочки с поли - акриламидным гелем для разделения на фракции. Разделение (фракцирова ние) белков проводят на приборе для диск-электрофореза Фирмы "Реанал", согласно известной методике 2 в холодильной камере (4 С), била тока в первые 30 мин не должна превышать 2 ф 2 МА на трубочку, затем ее увеличивают до 4 МА на трубочку.После.электрофореза гелевые столбики извлекают из трубочек и доме 25 Ьщают на 20 мин в пробиркиес раствором красителя и фиксатора (амидочерный 10 В в 73-ном растворе уксусной кислоты).После окрашивания гелевые стол" бики многократно отмывают 74-ным раствором уксусной кислоты до полного вымывания красителя, не связанного. . с белками.На отмытых гелефореграммах всех четырех проб-образцов кожи было выявлено 25-30 Фракций (табл. 2).Предлагаемый способ дает возмож- . ность получить в проЬе супернатанта Ьелка 600-1000 нг, а при разде-. лении этих проб методом диск-электрофореза в полиакриламидном ген выявить 25-30 белковых фракций с определенной электрофоретической подвижност ью.Распределение белковых зон и отдельных фракций на гелефореграммах различных проб - образцов нормальной кожи человека показано в табл, 2.Таблица 2960625 8ПЕодолжение табл. 2Пробы-образцы кожи (й ) белковые эоны быстрые пострансферрины 0,78 075 0,73 0,82 0,85 0,85 0,85 Трансферрин 1,18 1,18 1,18 1,18 Постальбумины 1,21 1,21 1,26 1,26 1,26 1,26 1,32 1,36 1,32 1,32 1,44 1,42 1,44 1,56 1)56 1,56 1,62 1,62 1,62 1,76 1,74 1,76 1,75 1,82 1,82 1,82 1,89 1,89 1 ф 89 1,89 Альбумины 2,12 2,12 2,12 Преальбумины 2,25 2,26 2,26 2,25 2,35 2,35 2,59 2,59 . 2,59 2,62 2,63 2,62 Итого 29 30 На чертеже приводится схема рас- эв положения на гелефореграммах выявленных белковых фракций нормальной кожи.Использование изобретения перопективно для оценки состоянИя защитных механизмов в преморбидном состоянии Я и при различной патологии кожи.Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том,2 1 34 что предлагаемый способ позволяет упростить процесс .и одновременно выявить больщее количество белковых фракций (до 29),что позволит по изме" нению состава фракций растворимых белков:кожи в патологии установить индивидуальные особенности различных кожных заболеваний. Продолжительность процесса сокращается до 1 ч.,70 8 НИИП Заказ 7253/50 Тираж 887 Подписное пиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная,Эформула изобретения1. Способ определения фракционного сотава растворимых белков кожи путем гомогенизвции пробы ткани, экстракции белков и центрифугирова ния с последующим разделением белковых фракций в супернатанте методом диск-. электрофореза в полиакриламидном геле, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью выявления боль 40 щего числа фракций и сокращения продолжительности процесса, гомогенизацию пробы ткани проводят одновременно с экстракцией в присутствии кварцевого песка и физиологического 13 раство,в соотношении 2: 1:4 в течение 20-25 мин, а центрифугирование 25 10осуществляют в течение 40-45 мин при8000 об./мин.2, Способ по и. 1, о т л и ч аю щ и й,с я тем, что пробу супернатанта, подвергаемую диск-электрофорезу, используют при содержании вней белка 600- 1000 нг.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Ежова Г.П., Добротина Н.Я. иДенисов В.М. Клиника,патогенез и терапия кожных болезней, Труды Горьковского мединститута, 1976, с. 21-252. Оач 1 з 8. Ь., ОщзСе 1 п . А пеий 19 Ь геьо 1 ой 1 оп е 1 есс горЬогеывейЬод,-"Ое 111 чай 5 ос. Гог йЬе зсцдуот 81 еод аС ахеиог 1 Асад, вед 1959,