Средство, обладающее иммунодепрессивным действием

О П И С А Н И Е (ц 933096ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советски иСоциапистическииРеспублик(5 )М. Кл. А 61 К 31/505 3 ЬвударатювВ каиитвт СР ив делам иаовретеии 11 и втаритийДата опубликования описания 07.06.82lтитут трансплантации органов и." тканей и химической Физики АН ССС 1 Р ь;.,фццаъеамОДЕПРЕССИВНЫМ средства на количествоетственных за выработкуитры гемагглютининов прии вторичном ответе. ител рвич о н Изобретение относится к Фармакологии и может быть использовано для биологических исследований.Известно химическое соединение 2,4,6-триметил-оксипиримидин.Цель изобретения - расширение арсенала иммунодепрессивных средств,Эта цель достигается применением 2,4,6-триметил-оксипиримидина в качестве средства, обладающего иммунодепрессивным действием, Были проведены исследования на мышах и морских свинках. При парентеральном введении средства обоим видам животных в дозах от 50 до 2000 мг/кг веса гибель.их отмечалась лишь начиная с дозы 1000 мг/кг.Иммунобиологические свойства средства изучены на модели одновременного определения лимфотоксического и митостатического действия в реакции гиперчувствительности замедленного типа и реакции бласттрансФормации, кроме того, изучено влияП р и м е р 1. Исследования митостатического и лимфотоксическогодействия ОПМ-Ш,Избирательное митостатическоеи лимфотокснческое действие сред 10ства изучено на экспериментальноймодели для одновременного их определения, основанной на реакции "трансплантат - против хозяина" и оценено по количеству колониеобразующих15клеток (КОЕ) в селезенке мышей после однократного внутрибрюшинноговведения препарата в дозах 50,100, 250 и 500 мг/кг веса. ПрепаратИразводят раствором Хенкса при нагревании до 50 С, рН раствора доводятдо 7,2-7,41.Митостатический и лимфотоксический эффект средства показан в табл.933096 Таблица 1 Митостатическииэффект Доза препарата,мг/кг КоличествоживотСреднее число эндогенных капоний на селе Среднеечисло Количество Лимфотоксивческийэффект(% выживэндогенных колонний жив от ных ных зенку после введения препарата на селеших энзенку мышей после догенных колонний) введения1 С лимфоцитов 26 (17-38) 24 (14-39) 24(16-35) 25(18-36) 22(1-24) З(0-10) 40 40 Митостатическийэффекточсутствует 1 О 40 50 100 40 40 250 500 40 Из таблицы видно, что введение препарата в дозах от 50 до 500 мг/кг не оказывает митостатического действия, т.е. не влияет на размножение эндогенных стволовых клеток. Избиратепьное лимфотоксическое дей- ствие средства, приводящее к отмене кванинактивации стволовых клеъок, отмечается .во всех исследованных дозах. При 50 мг/кг количество выживших КОЕ составляет 27%. Наибольший лимфотоксический эффект наблюдается при 250 мг/кг (46% КОЕ), Дальнейшее увеличение дозы .;до 500 мг/кг не приводит к увеличению КОЕ в селезенке. У. контрольных животных количество КОЕ около 10%. Полученные результаты показывают,что средство в исследуемых дозах обладает выраженным лимфотоксическим действием. Митостатический эффект препарата не наблюдается, что указывает на отсутствие угнетающего действия на костный мозг.П р и и е р 2. Влияние средства на реакцию гиперчувствительности замедленного типа.Морских свинок (4 группы по 5 в каждой) сенсибилизируют динитрохпорбензолом ДНХБ нанесением и выбиранием в выстриженные участки кожи спины по 1 капле 5% и 50% раствора. Средство вводят в подушечки лап в дозе 250 мг/кг по следующим схемам: 1 группа - одновременно с 7(6-13) 40 27 8(3-16) 40 31 12(7-28) 40 46 11(7-17) 40 42 сенсибилизацией и в последующие2 дня однократно, 2 группа - задень, в день и через день сенсибилизации, 3 группа - за два дня,за день и в день перед разрешающей30дозой ДНХБ 4 группа - контрольныесенсибилизированные животные, неполучающие препарат.Спустя 21 день наносят разрешающую дозу ДНХБ (1:2500, 1:1000,1:500,.1:250) и через 18-24 ч оцениваютреакцию гиперчувствительности замедленного типа РГЗТ по кожным реакциям (гиперемии инфильтрации, болезненности, шелушению кожи),При нанесении сенсибилизирующейф дозы ДНХБ в контрольной группе животных отмечалось резко положительная кожная реакция с болезненностью,отечностью, гиперемией, инфильтратами. В последующие дни появляетсяф 5 шелушение эпидермиса и струп в местах нанесения ДНХБ. При выделениисредства кожные реакции отличаютсяболее слабой интенсивностью (или отсутствием реакций) и спектром про 5 О явления (отсутствие болезненности,быстрее исчезала гиперемия, инфильтраты были меньших размеров)Разрешающие дозы ДНХБ через 24 ч вызывают у животных контрольной груп 55 пы отечность, болезненность, гиперемию при всех разведениях, У жи-.вотных получавших средство до сенсибилизации (2,группа), а также до5разрешающих доз ДНХБ (3 группа) только в разведении 1:250, 1:500 отмечалась .слабая гиперемия. При введении средства одновременно или , после сенсибилизации,(1 группареакция на разрешающие дозы ДНХБ более выражена и наблюдается даже в разведении 1:1000 и 1:2500.Полученные данные показывают, что средство тормозит развитие РГЗТ, причем более выражено при введении препарата до сенсибилизации.П р и м е р 3. Влияние ОПМ1 на количество антителосинтезирующих клеток ( АОК и титры гемагглютининов на пике первичного и вторичного отв та изучено у машей линии СВА, иммунизированных внутрибрюшинно 210 8 эритроцитами барана. Препарат вводят однократно в дозе 50, 100,933096 6250 и 500 мг/кг веса за день иммунизации, а также в дозе 250 мг(кг,по следующим схемам: 1 - в день, через день, через 2 дня и через 3 дняэ после первичной иммунизации и Пза 3 дня, за 2 дня за день и в деньперед второй иммунизацией, проведенной через 14 дней после первичной. Количество АОК в селезенке выемшей определяют модифицированнымметодом локального гемолиэа на 3-йи 4-й дни после иммунизации, Количество зон гемолиза рассчитывают на0 ядросодержащих клеток. Уровень1 антител оценивают в реакции гемаге- глюти нации.В табл, 2 локаэано количествоАОК в селезенке мышей при первичноми вторичном ответе после однократ 20 ного введения ОПМ.вичный ответ 3 280+20,8 249+30,4 0 5+2 8+27,1080+80,4 904+91,5 793+85,5 торичный ответ 2 250 30 09+15,3 0 После однократного внутрибрюшии". ного введения препарата за день до первичной иммунизации ьышей незначительно снижается количество АОК в селезенке даже в дозах 250 и 500 мг/кг.Введение препарата в день иммунизации и последующие 3 дня в дозе 250 мг/кг также оказывает слабый эффект на количество АОК при первичнбм ответе. Более выраженное дей". ствие препарата на количество АОК отмечается при вторичном ответе.Так уже при однократном парентеральном введении препарата в дозах 250 и 500 мг/кг за день до поврорной иммунизации число АОК уменьшается на порядок по сравнению с контролем, Эффект препарата при вторичном ответе также выражен при мнофф гократном введении.Титры гемагглютининов с сыворотке крови животных при первичном и вторичном ответе оценены на 4 день+113 ь и 1иммуи в за день изации 20 80+61,4 ель ноегидротой го после иммунизации. Средство вводят однократно в дозе 250 мг/кг за 24 ч до иммунизации.При первичном ответе введение препарата практически не снижапо количество антител ( титр в контроле 1:320, в опытной группе 1 ф 160- 1 ф 320), при вторичном ответе влияПроведенные исследованйя показывают, что новое средство обладает ингибирующим действием на клеточно 40 опосредованные иммунные реакциибеэ супрессии образования антител.Средство обладает лимфотоксическим эффектом во всех исследованных дозах (от 50 до 500 мг/кг), наиболь 45 ший эффект отмечается в дозе 250 мг/кг (46% выживших КОЕ). При сравнении с известными иммунодепрессантами аналогичное действие отмечено у гидрокортизона при введении 10 мг/кг (44% выживших КОЕ). При введе 50 нии животным 25 мг/кг гидрокортизоиа и выше быстро нарастает цито- токсичность препарата. Введение5 мг/кг резко снижает избиратлимфотокснческое действие, т.ерокортизон обладает малой шиспецифического лимфотоксическодействия. ние препарата на гуморальный ответ . не отмечается, тирты гемагглютининов такие же, как в контрольной группе,Влияние ОПИна количество АОК в селезенке мьппей в зависимости от схемы введения показано в табл. 3. Предлагаемое средство малотоксично ( не обладает митостатическим действием в дозах от 50 до 500 мг/кг не влияет на клетки костного мозгау и при этом обладает относительно высокой широтной избирательного лимфотоксического действия. Это является преимуществомперед используемыми в клинике иммунодепрессантами в том числе и глюкокортикоидами.Препарат тормозит развитие РГЗТ при сенсибияизации морских свинок ДНХБ,Предлагаемое средство обладает преимущественным действием на клеточно-опосредованные реакции бласттрансформации, РБГ, РНЗТ, Слимфотоксический эффект 1, зависящие не столько от дозы препарата, сколько от схемы введения. Наибольшее ингибирующее действие препарат оказывает при многократном введении, начатом9 9330до антигенного стимула 1, иммунизации,введения митогенов, сенсибилиэации).Снижение количества антителопродуцирующих клеток отмечается главнымобразом при вторичном ответе. Титрыантител при разных схемах введенияпрепарата не снижаются по сравнению с контрольной группой. С увеличением дозы (до 500 мг/кг) иммунодепрессивный эффект не возрастает, Оа даже снижается. В исследованныхдозах препарат не обладает цитотоксическим действием. Антипролиферативный эффект 1 п ч 1 йго также выражен относительно слабо ( концентрации препарата 100 и 250 мкг/мл ин гибируют включение НЗ-тимидина вДНК на 7 и 18 соответственно, а500 мкг/мл на 35 ., т.е. средство ока-.зывает слабое влияние на популяцию щТ-клеток-супрессоров). В то же время малые дозы препарата (50 мкг/мл)обладают стимулирун"чм дейСтвием.Полученные данные при сравнительномизучении антипролиферативной активности глюкокортикоидов показали, чтоони значительно ингибируют синтезДНК в лимфоцитах периферическойкрови человека в зависимости отдозы,96 10Так гидрокортизон и презнизолон в концентрации 0,5 мкг/мл включение Н-тимидина в ДНК на 40-503 по отношению к контролю, принятому за 100 . урбазон на 60-70 в концентрации 10 мкг/мл - на 50, 70 и 90% соответственно. Все препараты в концентрации 50 мкг/мл практически подавляют синтез ДНК, проявляя цитотоксический эффект.Средство обладает малой токсичностью, оказывает избирательное действие на клеточно-опосредованные иммунные реакции без подавления гуморального иммунитета и костномозгового кроветворения. Применение 2,4,6-триметил-оксипиримидина в качестве иммунодепрессивного средства может быть использовано в медицине при аутоимунных заболеваниях и при трансплантации органов и тканей.Формула изобретенияПрименение 2,4,6-триметил-ок 1сипиримидина в качестве средства, обладающего иммунодепрессивным действием.Составитель С.Иалютина Редактор Г.Прусова Техред З,фанта Корректор Л,Бокшан Заказ 4000 5 Тираж 714 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Фипиал ПИП Патент , г. Ужгород, ул. Проектная 4