Способ получения ингибиторов трипсина

(22) Заивдеио 1703.76 (2) 2335740/ С 12 О 13/00 рисоедииеиием зайвни Государственный комнт СССР по делам изобретений н открытий(088.8) 30,04.7 публии 479 та опубликовании описании 2) Авторы изобретеи Безбородов аиаЧерменс Андре ститут биохимии и физиологии микроорганизм Академии. наук СССР Заяви тел 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИ Изобретение отнкой промышленностичения ингибиторовмогут найти применисследованиях,Известен способ получения инров трипсина путем выращивания кры нродуцента на питательной срсодержащей источники углерода,та и минеральные соли, с последщим выделением целевого продуктиз фильтрата культуральной жидкти 111 .Однако продуценты, синтезирующингибиторы трипсина, используемыв известном способе, являются дфицитнцми. осится к медицин и касается полу тринсина, которы ение в медицинск ение йерапо 100 м качал- мператур ибитоульту картот е, о 10,тем посев переды и куль час на /л):пептонрп 6,8 е го срока идкости исактивность Фильтрат олитическую0 ия является упро изобр соба. щ тем, что в льзуют актипы: АсОпопту 2476 или юс(апбпнб25 ил5. нием ильтрат вно 0-ногоких час стоярастворе), в течение 118 и Асби нриЭта цель достигается качестве.продуцента исно номицеты фиолетовой груп сеь лотасене соп(пцб АСЫПОЩЦСЕБ оГаСЕиб 1074, Астапов ц се 6 Оп О 3 Астапов усев ма тогозеив пот себ м(оса т,ца 120 Способ поясняется сле мерами.П р и м е р 1. Продуцент3 апЖ 1 паз 118 выращивают вдвух суток в колбах Эрленмеобъемом 750 мл, содержащихпосевной среды, на роторныхках ,180- 200 об/мин) при те28 1 сССостав среды (г/л): крахмафельный - 10, дрожжевой экс10 мл, кукурузный экстрактЙОС 8 - 2,0, рй б 8-7,2. Заной материал в количестве 1носят в колбы со 100 мл сретивирование продолжают еще5 среде следующего состава (2бульон Хоттингера - 30 мл,5, глюкоза - 10, Маса - 5,7 т 2Но истечение указанно"ф фильтрат культуральной жпытывают на ингибирующуюпо отношению к трипсину.(0,1 мл) подавляет протеактивность трипсина на.7Биомассу удаляют фильтрона воронке Бюхнера, в фсят сульфат аммония до 2насыщения. После нескольния при температуре 4 СОЗ центрифугируют при 50003 659 10 мин., неактивный осадок отбрасывают, а раствор вновь насыщают сульфатом до 0,4 и, оставляют на ночь при температуре 4 С. Отделенныйцентрифугиронанием осадок содержал всю ингибирующую активность. Ингибирующугс активность выражают нингиби рования активности трипсина и определяют следующим образом.Контроль Р 1: в пробирки нносц".последовательно 0,2 мл раствора трип-г 0сина (рабочий раствор содержит0,1 мг/мл), 0,7 мл 0,1 М раствораборатного буфера рН 7,4 и 1 мл 2-ного раствора каэеина в том же буферЕ,после чего инкубируют н течелие 1530 мин при температуре 37 оС.Контроль 2: в пробирки внОсЯтпоследовательно 0,2 мл раствора трипсина, 0,7 мл боратного буфера, 0,1 млраствора ингибитора, 2 мл 10-ного 20раствора трихлоруксусной кислоты и1 мл 2-ного раствора каэеина,В опытную пробу вносят 0,2 млраствора трипсина, 0,7 мл боратногобуфера и 0,1 мл раствора ингибитора,смесь встряхивают и оставляют на15 мин при комнатной температуре. Поистечении этого времени н пробиркивносят 1,0 мл 2-ного раствора каэеи-,на и инкубируют как и контроль Р 130 мин при гемпературе 37 ОС. Послетермостатирования в пробирки с контролем Р 1 и в опытные пробы вносятпо 2 мл 10-ного раствора трихлоруксусной кислоты, в контроль Р 1добавляют 0,1 мл раствора ингибитора,встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 1.час. Осадки белков отфильтровывают, в Фильтратеизмеряют поглощение на спектрофотометре при Я = 280 нм. Отношение раэницы н поглощении контроля Р 1 иопыта к разнице в поглощении междуконтролем Р 1 и контролем Р 2, выраженное н процентах, есть единицаингибиронания активности трипсина. 45Осадок, полученный после осаждения сульфатом аммония, Растворяют н минимальном количестне 0,005 М раствора трис-НС 6 буфера" ,РН 7,4 и после диализа проводят гель-хроматографию на колонке с сефадексом ч = 75. Выход активного материала контролируют измерением ингибирующей активности,В результате гель-хроматограФии. получают дна пика, обладающие ингибирующей активностью. По скорости выхода из колонки активный материал имеет молекулярный нес 10-20 и 60-80 тысяч. Каждый из пиков сорби руют наДЕАЕ -1 целлюлозе, уравновешенной 0,005 М трис-НС 8 буфером, рН 7,4 и хроматографируют н градиенте Н аС 0 (0-1,0 М).Фракции,проянляю,щие ингибирующую актинность, собирают 65 610 4и после диалиэа протин ноды лиофилиэируют.П р и м е р 2. Культуру актиномицетата, относящегося к Фиолетовойгруппе Ас 1, ч 1 о 0 осеов соп 1 ггив2476 выращивают в условияхукаэанных в примере 1. Фильтрат культуральной жидкости, обладающий ингибирующей активностью, осаждают ацетономпри РН 5,0. Осадок отделяют центриФугиронанием, диализуют протин0,05 М К-Фосфатного буфера, рН -7,5и сорбируют на ДЕЛЕ-целлюлозе. Ко"лонку промывают тем же буферомдо выхода активного пика изатем хроматографируют н градиенте КС 1 (0,-0,8 М) до выхода второгопика, обладающего ингибирующейактивностью. Оба пика концентрируют,известными приемами (насьпцениесульфатом, ультрафильтрация, осаждение ацетоном) и подвергают гельхроматографии на сефадексе Г. Актинные по ингибирующей способностиФракции собирают и лиофилизируютП р и м е р 3. Ьктйномицеты,относящиеся к Фиолетовой группе.,например, АС 1. ЙососеОБ 1074Асг,. моРолобеоь 25 г" Ас 1. чоРа СиВ1205, культивируют н условиях,описанных в примере 1. По истечении72 часов Фильтрат культуральной жидкости испытывают на ингибирующую активность по отношению к трипсину,Фильтрат культуральной жидкости(0,1 мл) н условиях опыта поданляетпротеолитическую активность трипси-на на 50-70.,Ингибиторы трипсина имеют молекулярный нес 12-16 тысяч. Эти соединения ве растворяются в органических растворителях, имеют характерный для белков УФ-спектр и посвоей природе более близки природнымингибиторам трипсина, выделеннымиз жинотных тканей, а также из расти-,тельных объектон,Предлагаемый способ обеспечиваетрасширение сырьевой базы для получения ингибиторон трипсина, тем самым упрощая его технологию получения и снижение себестоимости прейарата,Формула изобретенияСпособ получения ингибиторон трипсина путем выращивания культуры продуцевта на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта иэ Фильтрата культуральиой жидкости, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, в качестве продуцента используют актиномицеты659610 Составитель С.МалютинаТехред,З.фанта КорректорО,Билак Редактор Н.Грязнова Заказ 2120/6 Тираж 525 Подписное11 НИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва, ЖРаушская наб. д.45 Филиал ПП 11 фПатент, г.ужгород, ул.Проектная,4 бфиолетовой группы: Ас 1.1 яотусеб иоЕасеие сопбпнб 2476 или Ас 6 пощсев юоЕосеоб ивлоб 1074,Ас 11 пощусев 1 ояй 1 яов 118 Ас 11 потцсеб, ч 100 оговеив 25 или Ас 11 потцсеб чоса 1.цб 1205. 6Источникй информации, принятыево внимание при зкспертиэеЮтегачча Н. Епхуте 1 пп 1 Ь 11 огв о 1тп 1 сгоЬ 1 ас ог 1 Д 1 п,То 1 суо Бп 1 чегв 11 у о 1Та уо Ргевв, 1972.