Плтитио1л 1« ttxutimlckaa библиотека

О П И С А Н И Е 24739ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советоииз Социалистическиз РеспубликК ПАТЕНТУ Зависимый от патентаКл. ЗОЬ, 6 МПК А 61 аявлено 19.Х,1967 ( 1193502/30-151 риоритет ыитет по дела ЛК 619 576 858 5:616.981.45:616 .988,75-085.372 (088.8) Опубликовано 20.Ч 69, БюллетеньаобретениК и открытпри Совете МинистраСССР а опубликования описания 13.Х 1.19 б 9 Авторы зобретения Иностранцы Чарльз Гейл и Эрл Ос Соединенные Штаты Америки Иностранная фирма Эли Лилли энд Компани Соединенные Штаты Америки. 1311 И П иЦ,11 Т 110- П.Х;М" ЬИ ь.1 ИОТЕ 1 И Заявитель АКЦИНЪ ПРОТИВ ТРАНСПОРТНОЙПНОГО РОГАТОГО СКОТА ОСОБ ИЗГОТОВЛЕН Л ИХОРАДКИИзвестен спосо тив транспортной го скота из куль Ьегпо 1111 са и Р, гп руса параинфлюэ дополнителем, и ния и консе ви б изготовления вакцины пролихорадки крупного рогатотур возбудителей Раз 1 ецге 11 а ц 11 осЫа:и культуры миксовинцыпутем смешения их с активации, концентрировавания полученной композинр роции,Лля получения вакцины, создающей более надежный иммунитет против транспортной лихорадки, предлагается новый способ. Культуры возбудителей Раз 1 ецге 11 а йегпоИ 1 са и Р. тпц 11 осЫа после их выращивания на питательных средах смешивают раздельно с культурой миксовируса параинфлюэнцы, выращенного в культуре клеток почечной ткани, а затем объединяют полученные вирусно-бактериальные смеси между собой и вводят дополнитель, содержащий ионы алюминия, с последующей или предварительной инактивацией соответствующим инактивирующим агентом, преимущественно формальдегидом, и нейтрализацией его избытка соответствующим абсорбентом, например бисульфитом щелочного металла, и консервируют путем добавления парэнтерально приемлемого антисептика, например симерозола. При смешивании культур бактерий с культурой вируса плотность отдельных вирусно-бактериальных смесей вы. равнивают до 5 - 10 ед. по методу Мс 1.аг 1 апс 1(а), а после смешения между собои этих отдельных смесей устанавливают рН полученной смеси до б,4 - б,8, Полученную смесь культур возбудителей смешивают с дополнителем,5 содержащим ионы алюминия, например, в гидроокисном геле, концентрация которых эквивалентна концентрации ионов алюминия в10 - 50 мл водного раствора, содержащего1,3% А 1 зОз. После выращивания миксовируса10 до момента проявления цитопатического эффекта у 50 - 70% клеток, жидкую тканевуюкультуру, содержащую вирус, перед смешиванием с бактериальными культурами охлаждают,15 Предлагаемый способ позволяет получатьудовлетворительно инактпвированные вирусно-бакгериальные композиции, способные создавать антигены, противодействующие развитию заболевания в организме животных.20 Миксовирус параинфлюэнцывыращиваюгизвестным методом на культуре монослоя ткани клеток почки эмбриональной или взрослойособи быка, кролика или обезьяны до момента проявления ЦПЭ у 50 - 70 Я клеток, Бак 25 терии выращивают раздельно на агарс илижидкости средней оболочки стенки кровеносного сосуда. При желании вирулентность бактерий можно увеличить путем пассажирования их на аллантожной ткани куриного эмбри 30 она или на тканевых культурах. Затем смеши 247139вают отдельные бактериальные культуры, отделенные от среды выращивания, с жидкой тканевой вируссодержащей культурой для получения отдельных оактериально-вирусных смесей. Эти смеси доводят затем до плотности 5 - 10 ед предпочтительно 7 - 9 ед. по методу Мс Раг 1 апс 1 (а), и, соединяя их между собой, получают комбинированную бактериально-вирусную смесь, рН этой смеси устанавливают 6,4 - 6,8, а затем смешивают с дополнителем, содержащим ионы алюминия в гидроокисном геле, дисперсии окиси алюминия или фосфате алюминия, причем концентрация ионов алюминия в этом дополнителе эквивалентна концентрации ионов алюминия в 10 - 50 мл водного раствора 1,30/,-ного А 1.0,Полученную таким образом композицию инактивируют формальдегидом, Р-пропилактоном, гидроксиламином, фенолом или хлороформом, предпочтительно, формальдегидом, излишек которого нейтрализуют подходящим раствором сульфитной соли. Пробы инактивированной композиции отбирают для проведения вирусно-антигенных исследований, а всю массу продукта консервируют парэнтерально приемлемым антисептиком в бактериостатических и фунгистатических количествах. Полученную смесь можно сконцентрировать путем сливания верхних слоев жидкости или использовать без концентрации.Культуры миксовируса параинфлюэнцыи пастерелл могут быть инактивированы до их смешивания. Смешивать их между собой можно до,или после смешивания с дополнителем. Предпочтительно вначале смешивать вирусосодержащую культуру с дополнителем, а затем - с инактивированными культурами бактерий, что позволяет исследовать отдельные вирусно-бактерыальные смеси с целью определения оптимального соотношения культуры вируса и бактерий.Культуры вируса, используемого для изготовления вакцин, должны вызывать ЦПЭ в почечных тканевых культурах через 2 - 5 дней, нейтрализоваться антисывороткой параинфлюэнцы, вызывать агглютинацию эритроцитов морской свинки и гемадсорбцию их на зараженных культурах. Титр агглютинации эритроцитов должен быть не ниже 1/40, а зараженность клеток тканевых культур порядка 10 и выше в 1 мл, Вирус выращивают на лакальбуминово-гидролизованной среде Эрла с добавлением или без добавления бычьей сыворотки. Кроме того, в среду можно добавить антибиотики (пенициллин или стрептомицин). Расплодочные культуры, лиофилизированные дистиллированной водой и подходящим стабилизатором, стерильно высевают на среду выращивания в количестве 4 - 6% ее объема и выращивают до титра 10 д, предпочтительно 106 в 1 мл, при температуре 35 - 38 С 2 - 7 дней. Насыщенные вирусом жидкости тканевых культур замораживают для сохранения вируса или сразу (без замораживания) смешивают с бактериосодержащими средами. 5 1 О 15 го 25 зо 35 40 45 50 55 60 65 4Бактерии выращивают на пригодных для этого средах известными методами. Среды для накопления засевают расплодками в количестве 1 - 5 от объема среды выращивания и культивируют при 35 - 38 С до бактериального титра 107, предпочтительно 10 жизнеспособных клеток на 1 мл.Отдельные культуры бактерий можно смешивать с жидкостью, содержащей пликсовирус, и затем - с инактивирующим агентом (формальдегидом), или все три культуры могут быть раздельно инактивированы добавлением к ним,необходимого количества раствора формальдегида. Большое значение имеет соотношение смешиваемых жидкостей, т. к, получаемая смесь должна обладать выше, упомянутой плотностью по Мс Раг 1 апс 1 (у). Для регулирования плотности можно также использовать формальдегид. По объему куль. туры бактерий не должны превышать 25% от полученной смеси.После приведения отдельных смесей бактерий и вируса к желаемой плотности и получения смеси отдельных вирусно-бактериальных смесей рН комбинированной смеси регулируют добавлением кислоты, папример 0,1 н. НС 1, или щелочи, например КаОН, до 6,4 - 6,8. Затем к ней добавляют компонент, содержащий трехвалентные ионы алюминия, например водный раствор подходящей алюминиевой соли или адсорбирующие твердые или водные гели, содержащие ионы алюминия. Например, можно использовать водную гидроокись алюминия, гель окиси алюминия или их водную дисперсию, а также соли алюминия и смешанные соли алюминия и различных кислот. Наиоолее приемлемы водный гель гидроокиси алюминия, водная суспензия алюминия и гидрат фосфата алюминия которые для большей активности следует брать с избытком (с осадком в жидкой фазе). Эти вещества можно получить реакцией обмена солей в водных растворах или суспензиях с последующим фильтрованием и промывкой и предварительной стерилизацией исходных реактивов.Компонент, содержащий ионы алюминия, смешивают с вирусно-бактериальной смесью или инактивированной культурой вируса в виде водных растворов или абсорбированных твердых дисперсий, имеющих концентрацию алюминиевой смеси от 0,5 до 5 вес,(предпочтительнее 1 - 2 вес. ). Причем, добавляемое количество должно быть эквивалентно 10 - 50 мл (предпочтительнее 10 - 30 мл) водного 17 о-ного раствора окиси алюминия (А 10 з) на 100 мл культуры, вирусно-бактериальной смеси или инактивированной культуры вируса,Смесь взбалтывают или перемешивают для получения однородной массы 15 мик. Для инактивации вируса и бактерий добавляют формальдегид в количестве, обеспечивающем инактивацию, 0,075 - 0,125 вес., но не влияющем на ослабление антигенности получаемой вакцины. Формальдегид можно исполь50 55 60 65 зовать в любой форме, обеспечивающей активность альдегида при контакте с вирусом или бактериями, например, триоксиметилен, твердый полиформальдегид или продукты конденсации формальдегида, которые выделяют формальдегид в водной среде. Формальдегидная композиция не должна содержать вещества, которые могли бы повлиять на состав вакцины.Инактивация вируса и бактерий должна проходить .в течение 6 час. Однако желательно выдерживать обработанные форм альдегидом культуры около 24 час, но не более четырех суток пр и комнатной тем пер атур е. После этого смесь концентрируют, если это необходимо, отделяя часть жидкости. Избыток формальдегида нейтрализуют подходящим абсорбентом, например 10 - 35/о-ным стериальным раствором бисульфита натрия. Если все три культуры инактивируют отдельно, избыток формальдегида можно нейтрализовать бисульфитом натрия до смешивания вирусный композиции с компонентом, содержащим ионы алюминия. Образцы окончательного продукта. отбирают для исследований по соответствующим стандартам, (определение оактериологической стерильности и безопасности). После проверки смесь консервируют подходящим парэнтерально приемлемым антисептиком, например хлороформом, фенолом или симерозолом, предпочтительно последним, в концентрации около 0,4 - 0,6 мл 10 О/,-ного раствора на 1 л основного продукта. Готовую вакцину сразу расфасовывают или хранят в холодильнике для накопления,Проверяют инактивацию вируса путем прививки шести пробирок с монослоями культуры бычьей почечной ткани 0,2 мл вакцины разбавленной 1: 30, взятой из общего объема до консервации антисептиком, с последующим 7 - 9-дневным наблюдением. При отсутствии цитопатического эффекта за этот срок вирус должен рассматриваться инактивированным.Активность вакцины определяют несколькими методами. По одному из них (метод гемагглютинационного замедления активности) отбирают шесть телят трех - шестимесячного возраста, которые имеют титры замедления активности кровяной сыворотки ниже 1:О. Трем из них прививают вакцину путем внутримышечной инъекции, дозы 10 смз с,интервалами между инъекциями в 2 - 3 недели.Шесть телят содержат вместе. Через 2 - 3 недели после второй инъекции проводят сравнение титров замедления активности, которое должно показать повышение титра сыворотки до 1: 80 и выше у вакцинированных телят при отсутствии значительного повышения в контроле.Защитные свойства вакцины можно определить также путем сравнения реакции организмов вакцин ированных и невакцинированных телят на воздействие комбинации миксовируса параинфлюэнцыи культур бактерий при введении их аэрозольным путем или внутрь 5 10 15 20 25 30 35 40 45 дыхательного тракта, или другим подходящимспособом. При этом у вакцинированных телятне исключается проявление симптомов транспортной лихорадки, таких как повышениетемпературы, кашель, раздражение слизистыхносовой полости. Такие симптомы наблюдаются и у контрольной группы.Антигенные свойства вакцины могут бытьустановлены путем двухкратного введения еебелым мышам весом 15 - 20 г в дозах по 0,2 млподкожно с интервалом в 10 - 14 дней и последующим введением десятикратно разбавленного вирулентного бульона Р. гпц 11 осЫа в течение 7 - 14 дней после второй инъекции. Антигенность вакцины считается удовлетворительной, если смертность у вакцинированныхмышей по крайней мере в два раза ниже, чему контрольных, при расчете 1.Рпо методуКсес 1 (а) и гпцспсЬ (а).Вакцину, полученную согласно описанномуспособу, рекомендуется применять в дозах2 - 15 смз при внутримышечном или подкожном введении. Рекомендуется вводить такжедве дозы по 10 слз с интервалом между введениями в 1 - 4 недели.Вакцину можно объединить с антигенами,вызывающими иммунизацию крупного рогатого скота против других различных заболеванийнапример, вызываемых возбудителямиВгцсе 1 а зр., С 1 оз 1 пйцгп зр., вирус бычьейдиарси (ВЧРЪ), бычьей инфекционной ппо 1 гасйеИ 1 з (1 ВК) и им подобных,П р и м е р. Изготовление вакцины.Грипсинизированные клетки культуры ткани эмбриональной бычьей почки (ВКТС), извлеченные из корковых участков почки, выращивают в пригодной для роста ВКТС жидкости и при температуре 35 - 37 С до слиянияВКТС. Затем отделяют верхний слой питательной жидкости и заражают клеточнуюкультуру вирусом параинфлюэнцы(штамм5 Г) путем внесения 1 лл вируссодержащейжидкости на 99 мл культуры. Вирус культивируют на ВКТС при температуре 35 - 37 С допроявления ЦПЭ у 65 - 100% клеток, которыйнаступает обычно через 48 - 96 час. Вируссодержащую жидкость из нескольких сосудовобъединяют и после взятия проб для определения НА титра, вирусного титрования и определения плотности массу живой ВКТС, содержащую вирус, инактивируют растворомформальдегида (формалином) (1 ч. формальдегида на 1000 ч, вирусной суспензии), который предварительно разбавляют до 10%-нойконцентрации средой, содержащей ВКТС.Инактивацию вируса сопровождают энергичным перемешиванием в течение 15 мин.Питательная среда для ВКТС представляетсобой смесь 24 г соли фенолсульфанилфталеина натрия, 8,160 кг хлористого натрия, 480 гхлористого калия, 246 г сульфата магния,172,8 г одноосновного фосфата натрия, 1,2 кгглюкозы, 318 г хлорида кальция, 6 кг гидролизата лактальбумина, 672 г бикарбонатанатрия, 8,3 г кристаллов пенициллина 6, 120 гсульфата стрептомицина и воды, добавленной до 1200 л. Смесь перемешивают 10 мин и стерилизуют при 121 С (250 Р) в течение 4 час, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 24 л бычьей сыворотки.Питательная среда для выращивания вируса на ВКТС содержит те же компоненты за исключением фенолсульфонилфталеина натрия и бычьей сыворотки. Кроме того, она содержит 2,бб 4 кг бикарбоната натрия вместо б 72 г,Расплодочную культуру Р, Ьегпо 1111 са, выращенную на трипсинозно-теаминированном агаре, выдерживают 18 - Зб час при температуре 3 С и впоследствии используют для засева трипсинозно-тиаминированного бульона. Возбудитель культивируют о - 18 час при 35 С в барабанах или бутылях, встряхиваемых в период выращивания, а затем сливают жидкие культуры в стерильные контейнеры. Среду для выращивания засевают 3 об. % расплодочной культуры,Плотность полученных культур при фото- метрическом определении равна 7 - 8 ед по шкале Мс Гаг 1 апй (а).Инактивацию культуры Р. ЬегпоИ 1 са проводят путем обработки раствором формальдегида в течение 48 - 72 час при температуре 35 С. Инактивированная культура сохраняется при 5 С до момента использования. Р, пегпоИ 1 са выращивают на среде, состоящей из 3,5 кг порошкообразного протеина марки Я-саяе и витаминизированной композиции, полученной путем вываривания казеина, 1,8 кг дрожжевого экстракта, 1,2 кг триптона, 120 г сульфата магния, 324 г одно- основного фосфата калия, 912 г двухосновного фосфата натрия, 9 б 0 г глюкозы на 90 л воды, подогретой до температуры 45 С, к которой добавляют дрожжевой автолизат. рН среды устанавливают до 7,2 - 7,3 добавлением 1,н. раствора гидроокиси натрия, а затем общий объем доводят до 120 л дистиллированной водой.Культуры Р. гпц 11 осЫа получают так же, как и культуры Р. 11 егпо 1 Шса, однако среда для выращивания содержит 480 г сахарозы вместо глюкозы. Перед инактивацией формальдегидом проверяют плотность культур. Перед смешиванием бактериальных и вирус,ных культур для определения их необходимых количеств также проверяют их плотность.Вирусную культуру перед смешиванием с бактерийными разбавляют, добавляя 360 лл 1,30% -ной стерилизованной суспензии окиси алюминия на каждый литр культуры с последующим перемешиванием в течение 15 мин. Затем ее оставляют при 30 С на 24 час, после чего верхний слой жидкости сливают, чтобы отделить объем, эквивалентный общему обьемч разбавленных бактериальных культур плюс 10 - 30% от общего объема вируснои культуры и суспензии окиси алюминия. Избыток формальдегида, используемого для инак 5 1 О 15 го 25 зо 35 40 45 50 55 60 65 8тивации смеси культур, нейтрализуют 35%- ным раствором бисульфита натрия.Консервируют смесь путем добавления симерозола (Мег(п 1 о 1 а 1 е 1 гас(е гпаг 1) в количестве 0,5 мл,на 1 л вакцины при помешивании.После отбора проб для определения стерильности, антигенных свойств и степени инактивации вируса вакцина хранится при температуре 5 С.Суспензию окиси алюминия готовят путем разбавления продажного геля окиси алюминия дистиллированной водой, свободной от пирогенов, а полученную суспензию пропускают через мельницу (ЕррепЬас 11 (а) для получения геля, который затем стерилизуют. Концентрацию геля окиси рассчитывают таким образом, чтобы содержание окиси алюминия составляло 1,3 вес. %.Полученную таким образом вакцину испытывают на телятах и морских свинках. Проверка подтверждает безвредность и эффективность вакцины,Предмет изобретения 1, Способ изготовления вакцины против транспортной лихорадки крупного рогатого скота из культур возбудителей Рая(ецге 11 а ЬегпоИ 1 са и Р, гпцИосЫа и культуры миксовируса параинфлюэнцыпутем смешения их с дополнителем, инактивации, концентрирования и консервирования полученной композиции, отличающийся тем, что, с целью обеспечения свойств вакцины, создающих надежный иммунитет против транспортной лихорадки, культуры возбудителей Рая 1 ецге 11 а ЬегпоИ 1 са и Р. гпц 11 ос 1 да после их выращивания на питательных средах смешивают раздельно с культурой миксовируса параинфлюэнцы-З, выращенного в культуре клеток почечной ткани, а затем объединяют полученные вирусно-бактериальные смеси между собой и вводят дополнитель, содержащий ионы алюминия, с последующей или предварительной инактивацией соответствующим инактивирующим агентом, преимущественно формальдегидом, и нейтрализацией его избытка соответствующим абсорбентом, например бисульфитом щелочного металла, и консервируют путем дооавления парэнтерально приемлемого антисептика, например симерозола.2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что при смешивании культур бактерий с культурой вируса плотность отдельных вирусно-бактериальных смесей выравнивают до 5 - 10 ед, по методу Мс Рагапс 1 (а), а после смешения между собой этих отдельных смесей устанавливают рН полученной смеси до б,4 - б,8,3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что полученную смесь культур возбудителей смешивают с дополнителем, содержащим ионы алюминия, например, в гидроокисном геле, концентрация которых эквивалентна концентрации ионов алюминия в 10 - 50 мл водного раствора, содержащего 1,3% А 120 з.247139 Составитель А. ЛеоновТехред Л. В. Куклина Корректор Г. И. Тарасова Редактор С. Лазарева Заказ 2887/17 Тираж 480 Подписное ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Раушская, д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после выращивания миксовируса до момента проявления цитопатического эффекта у 1050 - 70% клеток жидкую тканввую культуру, содержащую вирус, охлаидают перед смешиванием ее с бактериальными культурами.