Способ получения вакцины для профилактики и лечения инфекции мочевых путей

)тентной и научнотуре не обнаружен НИЯ ВАКЦИН ЕНИЯ ИНФЕ Ок областив частнос ологи ече акции. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ. (72) Любинко Стойк Павич (СН) и Вера. технической литера (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧ ЧЕВЫХ ПУТЕЙ (57) Изобретение о медицинской микроб ности к получению Сущность способа сводится к тому, что десять уропатогенных штаммов, выделенных от больных, .в число ко" торых входит 6 штаммов Е. со 11 и по 1-му штамму К 1, рпеишоп 1 ае, Р. шогцап 1 э, Р. ппгоЪ 11 з и 8. Хаеса 11 а, раздельно культивируют в жидкой или на плотной питательной среде, полученные биомассы инактивируют различными способами (тепловая обработка, -облучение или химическая обработка), Затем обработанные биомассы смешивают до конечной концентрации 2 О клеток/мл. Смесь бактерий сорби 9 руют на фосфате алюминия при концен-. трации последнего 1,5-10 мг/мл вак-цины. Для сохранения свойств вакцины добавляют тиомерсаль и при необходимости лиофнлизируют. 9 табл.Целлоб иоза Ксилоэа П р им е ч а н и е: "+" - кислота.Таблица 7 Бггерсососсцз Гаеса 11 з 676 Опыт О МочевинаТип гемолиза Негемолитический Желатиновый 0 гидролизВосстановление лакмусового молока Индол Эскулин + Рост на питательной среде 402 желчи 6,52 хлористогонатрия рН 9,6 Теплостойкость 60 С в течение30 мин Пр им еч а н ие:"+" положительный;отрицательный,Таблица 8"0" Штамм Обозначение Серологический тип ЕзсЬег 1 сЬа со 11 Гемолитический, типне определен ЕзсЬегдсЬа со 11 ЕзсЬег 1 сЬа со 11 ЕзсЬегдсЬда со 1 ЕзсЬег 1 сЬда со 11 ЕзсЬег 1 сМа со 11 Ес 455 БВ Ес 525 БВ Ес 560 БВ Ес 616 БВ Ес 654 БВ Ес 719 ЦВ 0 6: К 13; Н 1О 1: К 1: Н 70,4 : 63 : Н 50,75: - ", Н 5К - форма,Заказ 7093/57 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 РгоТепзшдгаМ 11 з 63 В Ргогеизшогяап 3.з58 В ЯггергососсцзГаеса 11 з676 145246220Таблица 9Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам получения лечебных вакцин,П р им е р, Сначала от пациентовкоторые страдали от инфекции идчевыхпутей, получают пробы мочи (среднеструйная моча) и сразу делают пересевнаагар МасСоп 1 еу. После эасеванияпластины с агаром инкубируют в течеоние 16-18 ч при 37 С, затем выделяютобразованные колонии и идентифицируютопределением их биохимических и биологических свойств,Индентифицирование Бгерососсия 15Гаеса 1 дя (энтерококка) с использованием метода окраски по Граму характерных небольших колони 1. и следующих испытаний:каталаза (в присутствии 20подогретой крови)гемолизрост при 45 С +рост при рН 9,6+определение полисахарида -антигена 0 +В табл.приведены критерии, при меняемые для идентификации штаммовЕзсЬегдсйда со 1 д, Ргоеив и К 1 еЪяде 1.1 а,Идентифицированные таким образомколонии оставляют на пластинах соагаром в течение 24 ч при 37 С для,альнейшего роста, затем суспеидируютв физиологическом растворе хлористогонатрия, испытывают на чистоту припомощи метода окраски по Граму и эа-мораживают в сухом виде,Полученные отдельные штаммыЕвсйегдсИа со 1 д характеризуютсяпризнаками, приведенными в табл, 2,В табл. 3 приведены биохимическиесвойства штаммов ЕвсЬегдсйда со 1 дВ табл. 4 представлены признаки,характеризующие штаммы Ргоеив иК 1 еЬяде 11 а.Биохимические свойства штаммовРгогеив и К 1 еЪвде 11 а представлены вБОтабл. 5,В табл. 6 представлены признаки,характеризующие штамм Бгергососсивдаеса 1 дв.55Биохимические свойства штаммаБгерТососсив Гаеса 1 дя приведены втабл. 7,Морфологические свойства выделенных штаммов можно обобщить следующим образом.ЕясЬегдс 1 па "со 1 д: грамотрицательные палочки, 1,1-1,52,0-6,0 р и (живая форма), подвюкны благодаря жгутикам.Ргоеив шдгаЪд 1 дв и Ргоеиз шогяапдд: грамотрицательные палочки,0,4-0,6 ф 0,1-3,0 рм беэ оболочки, подвккны, со жгутиками (не все).К 1 еЪяде 11 а рпеишопдае: грамотрицательные, неподвижные палочки, 0,3150,6-6,0 им.Бггерсососсиз Гаеса 1 дв грамотрицательные шарообразные кокки, 0,51, 0 ш м, неподвижные.Нтаммы ЕясЬегдсЬда со 1 д исследуютзатем на их серологические свойства,и для этой цели сначала на предметномстекле проводят тест на склеивание смноговалентными ОК-сыворотками А, В,С, О, Е. Данные приведены в табл. 8.Указанные 1 О штаммов депонированыв Центральном Бюро плесневых культур(Нидерланды) под названиями СВБ 516,34до СВБ 525,84 и переведены в немецкую коллекцию микроорганизмов (ФРГ)под входящими номерами РБМ 3229-ОБМ3238.Для получения вакцины штаммыотдельно культивируют на твердойили жидкой питательной спеде; предпочтительно применяют твердую питательную среду, например питательныйагар, который имеет следующий состав, г/л:Мясной экстракт(Васо Веей Ех- гасй) 3Бакто-пептон 5Хлористый натрий 5Бакто-агар 15Среду стерилиэуют в течениео15 мин при 121 С, она имеет рН около7,2,Для промышленного получения применяют Коих-баллоны, для полученияв лаборатории применяют чашки Петри,Инокуляцию осуществляют при помощипосевного материала, несколько миллиметров которого равномерно распределяют по всей поверхности, Коих-баллоны закрывают бумажной пробкой исреду хранят на складе инокулированной поверхностью вниэ. Инокулированные культуры инкубируют в течение24 ч при 37 С.40 14524Поверхность разрастания колонии бактерий смывают необходимым количеством (в зависимости от плотности роста культуры в сосуде) буферного раствора фосфата - раствора хлористого натрия (РВБ) при легком раскачивании, не нарушая поверхности агараИз каждого баллона или иэ каждой 10 чашки Петри берут мазок, окрашивают по методу Грама и проверяют на чистоту, Баллоны или чашки Петри, которые окажутся загрязненными, выбрасывают. Суспенэии, которые происходят 15 от одного штамма или от сбора, смешивают с помощью стерильного сита из нейлоновой ткани.Инактивирование, как и само культивирование, для каждого штамма про водят отдельно, Его можно осуществлять нагреванием при температуре около 55-60 С в течение приблизительно 1 ч, обработкой раствором формальдегида или облучением-лучами,25Полученные биомассы соединяют, инактивируют на водяной бане при,о6" С в течение 1 ч и после теплового инактивирования добавляют фенол (предельная концентрация 0,357), 30Пробу суспензии берут для опыта на стерильность и для испытания на идентичность и концентрированное запасное количество хранят в холодильном шкафу. 35Если опыты на стерильность через1 ,3 дня не показали никаких загрязнений, процесс получения ведут дальше. За опытом на стерильность наблюдают в течение 14 дней и если ,проба на стерильность показывает рост каких-нибудь организмов, этот сбор устраняют.Содержимые сборников (инактивированные суспензии, которые происходят от одного щтамма) центрифугируют при 3000 об/мин в течение ч в охлажденной центрифуге (Яогга 1 4 СК, центробежный ротор 2000), супернатант удаляют, и осадок бактерий суспендируют в растворе хлористого натрия, который содержит 0,012 тиомерсаля. Суспензию хранят при 4 С (+2 С).Концентрированные суспензии 10 штаммов Е. со 1, Ргогеця шхгаЬ. - 1 я, Ргогеця шогяагпя, К 1 еЪяде 11 а рпецшопае, Бггергососсця Еаеса 1 я смешивают таким образом, что в 1 мл содержится Е, со 1 д 6 штаммов, каждо 624го 2,5 1 ОЯ, всего 1,5 10 микробо ;Ргогеця ппгаЬд 11 я 1 штамм, 7,5 10микробов; Ргогеця шограпдь.1 штамм,7,5 10 микробов; К 1 еЪя 1 е 11 а рпецшопае 1 штамм,3 1 О микробов;Яйгерососсця Гаеса 1).я 1 штамм,5 О микробов, Вместе - 2 1 О микро 9бов/мл.Так как добавляют алюминийфосфатный гель, концентрация соответственно должна быть выше, Алюминийфосфатный гель получают следующим образом.854. г калийалюминийсульфата фк 12 Н, 0 растворяют в бл воды и фильтруютЗатем растворяют 685 г тринатрийфосфата 12 НО в 6 л воды.Раствор алюминия выдерживают прио37 С. Оба раствора одновременно выливают в 2 л воды. Осадок центрифугируют, повторно суспендируют в 13 лводы и суспензию снова центрифугируют.Далее осадок повторно суспендируют, доводят до общего объема 8,1литра, устанавливают при помощи5 н, аОН величину рН 6,0 и выдерживают в автоклаве в течениеч прио121 С. Этого количества достаточно,чтобы получить 66 л вакцины с 3 мгАРО 4 /мл или 0,66 мг А/мл.Адсорбированную вакцину послепроверки величины рН, которая должнасоставлять 6,2-7,0, разливают в стерильные не содержащие пирогена ампулы емкостью 1 мл в количестве 0,5 млна дозу. Вакцину во время разливаниявзбалтывают.Общее число инактивированных микроорганизмов в одной дозе, т,е.0,5 мл, составляет около 1 109Наконец, вакцину испытывают:на стерильность по Европейскойфармакопее;на токсичность по предписаниямВсемирной организации эдравоохранения (прирост веса у мыши;на ненормальную токсичность ноЕвропейской фармакопее.Вакцина может быть получена в лио"филизированной форме,Концентрированную инактивированную суспензию, полученную аналогично описанному, разбавляют таким образом, чтобы она в 0,5 мл содержала около91 О инактивированных бактерий укаэанного состава. Для разбавления применяют 1 Е-ный раствор гуманальбумина5 145или заменителя плазмы с 0,017 тиомерсаля в 0,85 н. растворе 11 аС 1.Флакончики объемом 2 мл наполняютпри стерильных условиях 0,5 мл описанной разбавленной суспензии заомораживают приблизительно при -45 С,после этого сушат в вакууме в лиофилиэационном аппарате. Температураосушки не должна превышать +Зб С. Весьпроцесс лиофилизации продолжается24 ч. После лиофилиэации флакончикизакрывают резиновыми пробками в атмосфере азота и алюминиевыми колпачхами,Для введения алюми.:йфосфата, одновременно используемого в качестверастворителя для повторного растворения, перед наэн:.чением применяютводный алюминийфссфатный гель с концентрацией А 1 РО 4 2 мг/мл, АлюминийФосфатный гель, прежде чем его разливают в ампулы, разбавляют растворомхлористого натрия до такой степени(около 12 раз), чтобы конечная концентрация была 2 мг/мл. Разливаемое количество в ампулыемкостью 1 мл составляет 0,5 мл.Для испытания вакцины на стой 2462б штаммов бактерий суспендируют с 9 млпитательной среды и инкубируют кульатуру при 37 С в течение 24 ч. Вторую вспомогательную культуру применяют для приготовления антигенов.600 мл питательной среды инокулируют при помощи посевной культуры(каждый штамм отдельно), Культурыо1 О инкубируют при 37 С в течение ЗЬ ч,После этого добавляют Формалин доконечной концентрации 0,13. Культурыинкубируют при 37 С в течение 7 дней.Каждую культуру испытывают после 15 этого на отсутствие живых бактерийи на стерильность. Инактивированнуюсуспензию бактерий центрифугируютв охлаждающей центрифуге в течение1 ч при 3000 об/мин, Осадок повторно 20 суспендируют в буферном растворе фосфата - растворе хлористого натрия(рН 7,2) - так, чтобы достигнутьконцентрации около 20 10 бактерий/мл. Для пробы на агглютинацию925 применяют около 2 10 .бактерий/млв качестве агглютиногена.Опыт на агглютинацию.Сыворотки мышей в 1:2-стадияхразбавления разводят буферным раство30 35 40 45 50 55 кость при хранении дважды определяют ее способность к образованию антител у мыши.Иммунизация мышей.1 пести группам по 10 мышей каждая (мужского пола, ММ 8.1-штамм, вес 16- 20 г) проводят иммунизацию интраперитонеальным введением вакцины. Две дозы (0,5 мл вакцины) впрыскивают с интервалом в две недели. 20 мышам из того же выращивания и с таким же весом, которые служат в качестве контрольной группы, впрыскивают только алюминийфосфатный гель (0,5 мл). Через дне недели после второй инъек-. ции берут стерильно кровь и объединяют по группам. После свертывания получают сыворотку от каждого объединения центрифугированием и хранят при глубоком замораживании прио-22 С до серологического испытания.Приготовление антигенов (агглютиногенов).Девять гомологических штаммовбактерий, которые содержатся в вакцине, применяют для получения анти- генов; штамм Ес 654 нельзя было агглютинировать (К-форма) и его нельзя применять в качестве агглютиногена. Лиофилизированные культуры ром фосфата - физиологическим раствором хлористого натрия с рН 7,2, По прошествии 18 ч при 37 С и остальных 24 ч при 4 С снимают показания реакции. В качестве титра соответствующей сыворотки принимают максимальное разбавление, при котором еще можно было установить видимую агглютинацию бактерий.Для агглютининовых титров сыворо ток мышей были, найдены геометрические средние значения, приведенные в табл, 9.Иэ этих результатов следует чтоо вакцина при хранении при 4 С сохраняет свою полную эффективность по меньшей мере в течение двух лет.Показаниями вакцины являются особенно цистит, простатит, цистопиелит и пиелонефрит.Пациенты, которые не имеют острого лихорадочного состояния (противопоказание), получают с интервалами от 1 до 2 месяцев всего 3 внутримышечные инъекции по 0,5 мл вакцины. При появлении сильных реакций на вакцину лечение следует прекратить. Через год после этого следует провести ревакцинацию в той же дозе.7 4524Формула изобретения Способ получения вакцины для профилактики и лечения инфекции мочевых путей, заключающийся в том, что используют десять уропатогенных штаммов бактерий, из которых шесть штаммов Еясйег 1 сМа со 11 Ес 455 ПВ, Ес 525 ПВ Ес 560 ЦВ, Ес 616 ОВ, Ес 654 ОВ и Ес 719 ПВ и по одному штамму К 1 еЬзде 11 а рпецшоп 1 ае 16 В, Ргоеця ппгаЬ з 63 В, Ргоеця шогяапз 58 В и.Таблица 1 Е. со 11 РгоСеця Ргогешогяап 1 я ця шдгаЬ 111 я К 1 еЪз 1 е 11 а Критерии рпецшоп 1 ае Подвижность Рост в КСИ-среде Газообразный углеводглюкозы Кислота лактозы+ И) ксилозы Мелатиновый гидролиз Индол Уреаэа Цитрат как С-источник Н Б ТБ(тройной агар сахаражелеза) Лиэиндегидрокарбоксилаза 62 8Бггергососсця йаеса 11 я 676, при этом все штаммы выращивают раздельно, инактивируют тепловой обработкой прио55-60 С, или формальдегидом, или гамма-облучением, затем культуры смешивают, при этом конечная концентрация всех бактерий в вакцине составляет 2 1 О клеток/мл, полученную9смесь бактерий сорбируют на фосфате алюминия при концентрации его 1,5- 10 мг/мл вакцины и затем в целевой продукт добавляют тиомерсаль.1 ОТаблица 2 1452462 Ферментация углеводов Штамм ЕзсЬегдсЬда со 1 Углевод(ЭБМ от 3229 до 3234) Лактоза + О Сахароза О О Маннит Мальтоза + Мелибиоэа + Рафиноза О О О О О Рамноза Треалоза + Салицин О О О О О Рибоза Амигд алин О О О О Галах то за + Адонит (рибит) О О О О О О О О О Инозит О О О О О О О О О О П р и м е ч а н и е: "+" - кислота. СорбитАрабинозаГлюкоза МаннозаФруктоза ДульцитЦеллобиозаКсилоза 455 ПВ 525 БВ 560 0 В 616 УВ 654 ОВ 719 ИВ452462 12 Таблица 3 Опыт 455 ЦВ 525 1 В 560 1 В 616 ОВ 654 ОВ 719 ОВ О О О О О О Мочевина Гемолиэ на пластинах крови с агаром О О О О Желатиновыйгидролиэ О О О О О О О О О Н Я Подвижность П р и м е ч а н и е: "+" - положительная за 24 ч;"О" - отрицательная после 72 ч. Таблица 4ферментация углеводов Углевод О О Лактоза О О Мальтоэа О Мелибиоза О Рафиноза О Рамноэа О Рибоза О О Амигдалин ЦитратИндол СахарозаМаннит ТреалоэаСалицин К 1 еЬэ 1 е 11 а Ргойецэрпеишоп 1 ае ппгаЬ 11 эК 1 16 В 63 ВО Мочевина О О О ром О Цитрат Индол О О О О й СорбитАрабиноза Адон ит(рибит) Гемолизна пластинах крови с агаЖелатиновый гидролиз О Продолжение табл.4"О" -отрицательная после72 ч,Таблица 6Ферментация углеводов акто Сахароза ни Мальтоэ Мелибио э О Рафино з Рамноза еалоза(рибит) озит уль СалицинРибозаАмигда 1452662 Продолжение табл.5