Способ количественного определения вируса в вирусных смесях

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик 7 О 4986 Ф.80 я описания 05 Г. А. Алпатова,и Т. Ф. Журавель Эльбе 72) Авторы изобретени Крутянск 1) Заявител Институт полиомиелита и вирусных Академии медицинских наук С нцефалитовСР ПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИ В ВИРУСНЫХ СМЕСЯХ(5 О чт й см сят ащий кро слено оого, бт25 Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается биологического контроля живых вирусных поливалентных вакцин.Известен способ количественного определения вируса в вирусных смесях, включающий заражение культуры ткани, инкубирование ее с последующим нанесением питательно-покровного агара и определением концентрации вирусапо количеству бляшек (1.Однако такой способ не обеспечивает, высокой чувствительности и точности определения.Цель изобретения - повышение чув-тствительности способа и точности определения.Это.достигается тем о культуру ткани заражают вирусно есью и после инкубирования нано питатель покровный агар, содерж антисыв ротки ко всем вирусам, ме искомСпособ осуществляют дующим о разом.При титровании используют одно илидва разведения испытуемого материала. На каждое разведение используют не менее трех Флаконов с монослойными культурами первичных клеток в возрасте 6-8 дней. При, использовании флаконов емкостью 5,0-100 мл объем вводимого в них материала (инокулята) 0,1 мл, а для.флаконов емкостью 250 мл - 0,2 мл,Перед заражением флаконы тщательно промывают питательной Средойили раствором Хенкса. После этого производят полное и тщательное удаление промывочной среды. После заражения Флаконы выдерживают в течение 1-2 ч при температуре 22-37 С.С целью полной .адсорбции вируса необходимо его равномерно распределить по всей поверхности монослоя кле ток, для чего применяют периодическое (через 15-20 мин) покачивание Флаконов, Через 2 ч зараженные и контрольные Флаконы заливают питательным по- кровным агаром, в состав которого добавляют имунную типоспецифическую сыворотку или их смеси в заранее установленной концентрации. Эту концентрацию устанавливают так, чтобы имела место полная, нейтрализация гомологического штамма (штаммов) вируса при сохраненйи титра гетерологичного штамма Объем питательно-покровного агара для Флаконов емкостью 100 мл - 10 мл, для флаконов емкостью 250 мл 5 мл. После затвердевания питатель7049864но-покровного агара флаконы перевора- Контроль на общее содержание ви"чивают агаровым покрытием вверх и ин- руса в исследуемой поливалентной наккубируют при температуре 33-37 С, цине, Три флакона с культурой зара Рецептура питательно-покровного жают разведениями испытуемой вакцины,агара на 100 мл (зависит от природы как описано выше. Зараженные флаконывирусаикультуры ткани), мл: - 5 заливают питательно-покровным агаРаствор Эрла 10 9 .Ром, не содержащим имунные типоспе Дистмллированная вода28 цифические сыворотки Устанонле й( мл беэимуннойв этом опыте вирусный титр не должеыворотки) ." отличаться более чем на 20 от с мнмесь имуннйх "сывороток1 О мы вирусных титров каждого компонендвух типов вируса 2 та поливалентной вакцины, УстановНормальная бычья "сы-ленных в основном опыте.воротКаили обезжиренная :. Контроль на специфичность имунных1,8 сынброток, Каждую примененную в ост яРаствор бикарбоната на - , новном опыте имунную типоспецифичесрия (7,5) 8,1 кую"сЫноротку или их смесь исследуют15Нейтраль-рот 1/1000 1,5 в рабочем разведении со стандартны 3-ный раствор расплав-" . . . . Ми вирусами всех серотипов, иэ котоленного агара Диско50,4 " Рых состоит испытуемая вакцина. ВиОкойчательный подсчет блашек про- Русы применяют в дозе, вызывающейводят на 5 день. . образованйе 30-50 бляшек во флаконеКоличественйое содержание отдель- в отсутствии имунных сывороток. В слу ных вйрусных-компонентов в 1 мл ис- . чае гомологичных сочетаний сыворотки"Следуемой вакцины определяется сле- . (сывороток)с вирусом не должно обра-. дуюшим образом, : . " " "- зонываться бляшек н течение срока наОпределяют среднее количество бля 25 блюдения.шек в одном Флаконе в каждой опытнойВ случае гетерологичных сочетанййпаРтии, соответственно примененной сывороток с вирусом количество обра-.имУннбй типоспецифичеокой сыворотке"эуемых бляшек не должно Уменьшаться" ИЛИ"СМЕСИ тахиХ СйвсрОтОК, -"бОЛЕЕ ЧЕМ На 10 ПО СраВНЕНИЮ С тИЭто количество умножают на разве-30 тром"вируса, установленного в отсут дение вакциойной пробй и на ббратную стнии имунной типоспецифической сывеличину объема вирусного инокулята, воротки,Полученная величина обознаЧается П р и м е р. Количественное опреКак число бляшкообразующиХ единиц деление отдельных типов вируса по" в 1 мл (БОЕ/мл) и может быть вйраже лиОмиелита в живой трехвалейтной вакна в абсолютйыхвелйчййах или числом цине .10 с соответствующей степенью. Если Делают десятикратные разведениянеобходимо определить содержание ви-; вакцины,до 10 на растворе эрла илируса н одной приВивочной дозе, то по- на среде с 0,5 гидролизата лактальлученное значение делится на количе бумина. Флаконыс семидневной куль ство"доэ в 1 мл исследуемого-матерИ- турой Почек ЗЕленых мартааек заража-.ала; . . .. :- . - " -." .ют по 0,1 мл как описано выше, и заливают питательно-покровным агаромДанный опытсопровождается следую- "в который добавляют смеси имунных тищими контролями"." : ". " поспецйфических сывороток. Для:опреКонтроль на чувствительность куль" . деления титра вйруса 1 типа в трех тьры гКанмк вирусу. Три Флакона тойвапентной вакцине (флаконЫ 1, 2, 3). же"йартии"культур ткани, что и"дйя " .н-питательно-покровный агар добавля" осиовного-опыта, .заражают сандарт- , :ют смесь сывороток 11 и 111 типов;ными" вирусными штаммами тех же типон, дляопределения титра вируса 11 типачто в исследуемой вакцине. титры этих (флаконы 4, 5; 6) - смесь сыворотокштаммов устанавливают заранее путем . . 1 и.111 тийов и для определения титф многократного. титронания инйведеиия:. Ра вируса 111 типа (флаконы 7, 8, 9)- средйего значения тйтра. количество . смесь сывороток 11 и 1 типов. Опытбляшек обраэующихся"в ЕтИх флаКОнаХ, .;сОПРОвсжДаетСя всеми необходимымине должно отклоняться от заранее ус контрольными испытаниями, описанны-тановленног 0 среднего титра более . ми выае, Через 5 дней инкубации зачем в 2 рава.::- : :Раженных и контрольных культур проКойтроль кулЬтуры ткани"на отсУт- воДЯт поДсчет бляШек в Каждом фластвие бляшкообразующих вирусов-кон- коне и высчитывают титры вирусов.таминатон.Дна незараженных флакойа 60 Предлагаемый способ обеспечинаетот "той Ге"партйи культуры тканиза-,. "нысокую чунствйтельность и точностьливают питательно-покровнйм агаром, определения.н который не добавляют имунную типо-. Формула изобретенияспецифическую сыворотку (или смесь Способ количественного определесывороток)."" б 5 ййй"вйруса"в"вирусных смесях, вклю-,ц,704986 Составитель С. МалютинаТехред Н,Вабурка Корректор О, Ковинская Редактор А. Бер Тираж 52 б ПодписНоеЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий Заказ 7965/29 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП ффПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 чающий заражение культуры ткани,инкубирование ее с последуяаим нанесением питательно-покровного агараи определением концентрации вирусапо количеству бляшек, о т л и ч аю щ и й с ятем, что, с цельюповышения чувствительности способа и точности определения, культуру тканизаражают вирусной смесью и после инк убирова ния на носят питатель но-покровный агар, содержащий антисыворотки ко всем вирусам, кроме искомого. Источники информации,5 принятые во внимание при экспертизе1. Руководство по иммунологии.