Способ получения липида а из грам-отрицательных бактерий

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ а- еивлюложнотабл тся к биотехк способам поактивных вещест Изобретение относи нологии, в частности лучения биологически из бактерий, а именноЦель изобретениянологического процесс выхода целевого продСпособ основан на гидролизе биополимеро ственно в бактериальн сью хлороформ - метано соляная кислота 10:(1 ипида А, упрощение тех".: а и повышение укта.избирательном в непосредых клетках смел - 0,9-1,8 Ж-ная7-21): (7-12) . ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ П(НТ СССР(71) Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществгидробионтов(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДА А ИЗГРАМ-ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения биологически активных веществиз бактерий. Цель изобретения - упрощение технологического процесса иповышение выхода липида А при получении его из грамотрицательных бактерий. С этой целью лиофильно высушен-,ные бактериальные клетки экстрагируют не менее трех раз по 4,5 ч 2550-кратными объемами смеси хлороЯО 1581718 А 1(51)5 С 07 Н 13/06 А 61 К 37/20 2форм - метанол - 0,9-1,87-ная соляная кислота, взятых в объемном соотношении 10: (17-21): (7-12), объединенный экстракт разбавляют хлороформом и водой до установления в смеси равных объемов растворителей, нижнюю фазу образовавшейся двухфазной системы упаривают досуха, остаток хроматографируют на колонке со сфероном ОД, колонку предварительно промывают ацетонитрилом и смесью ацетонитрила и изопроланола, взятых в объемном соотношении (4-5);1, после чего изопропанолом вьмывают липид А, который перекристаллизовыв ют из ацетонитрила. При осуществл нии способа из 1 г сухих клеток Р. Ыппеяо 1 а Вполучают 5-6 мг липида А, а из БЬ. Г 1 ехпегх 2 А - 1 - 2 мг липида А с содержанием основного вещества не менее 95 Е, Способ может быть осуществлен практичес" к бом масштабе и не требует с й аппаратуры, 1 э,п. Ф-лы,Эта смесь обеспечивает удовлетворительную скорость гидролиза липополисахаридов при комнатной температурепрактически не расщепляет липид Аи достаточно эффективно извлекаетего из клеток. Кроме того, в указанных условиях обработки биоматериалапроисходит деструкция или необратимая модификация кислотостабильныхкомпонентов клетки, вследствие чегов экстракт переходит значительноменьше примесей, чем при извлечениинейтральными системами. рас творителей.Обработку биомассы проводят трехкратно, каждый раз не менее 4,5 ч,используя 25-50-кратные объемы раст 5ворителей. При сокращении числа стадий экстракции. (табл. 1), продолжительности каждой Стадии и объемаэкстрагента не достигается полноеизвлечение целевого продукта. Увеличение объема смеси растворителейвызывает переход в экстракт большихколичеств трудноотделимых примесей,в особенности мембранных Фосфолипи-.дов. Активному извлечению последнихспособствует также повышение содержания хлороформа в экстрагенте, качество конечного продукта в этомслучае снижается. Увеличение долиметанола или/и соляной кислоты в смеси растворителей приводит к: во-первых, к неполному извлечению липида А, во-вторых, к загрязнению экстракта нелипидными примесями. Прииспользовании кислоты с концентрацией выше 1,8 Х липид А заметно деградирует, а кислота с концентрациейменее 0,9 Е не обеспечивает количественного гидролиза липополисахарида,вследствие чего выход целевого продукта падает,Количество липида А в экстрактахв процессе его извлечения из клеток Яа 3 топе 11 а ппппево 1 а ВиЯМде 1 Ха Г 1 ехпег 2 А по отношениюк максимально извлекаемому количеству (по результатам 9 процессов выделения) представлено в табл, 1Для удаления водорастворимыхвеществ из экстракта к нему добавляют хлороформ и воду до достиженияравных (+57.) объемов всех трех растворителей в смеси. В результате образуется двухфазная система, где липид А практически полностью находит, ся в нижней Фазе, а гидрофильные примеси - в верхней. При увеличении количества хлороформа в смеси растворителей не обеспечивается максимальное освобождение от примесей. Уве 50личение доли воды или/и метанолавлечет потерю части целевого продукта с верхней Фазой и снижает еговыход.На стадии основной очистки липида А применяют колоночную хроматографию с обращением фаз на сферонеОД 1000. В данной конкретной операции сферон имеет существенные преимущества по сравнению с сефадексомЬН, предложенным ранее для очист-ки липида А (1), вследствие значительно большей его селективностии технологичности,Вещества вносят в колонку в ацетонитриле, Этим же раствором вымывают полярные примеси, а для удаления менее полярных примесей используют смесь ацетонитрил - изопропанол(4-5):1. Увеличение дозы изопропанола в смеси растворителей приводит кчастичному элюированию липида А вместе с примесями и снижению его выхода; при уменьшении содержания изопропанола полное удаление примесейне достигается. Окончательную очистку целевого продукта осуществляютпутем его перекристаллизации из ацетонитрила, после чего продукт сушатв вакууме, Выход липида А при получении его из Я. ш 1 ппезоСа Всоставляет 5-6 мг/г сухих клеток, а изЯй. 11 ехпег 2 А-2 мг/г сухих клеток содержание основного веществав обоих случаях не менее 953,Структура и состав полученныхпрепаратов доказана методами ТСХ,ВЭЖХ, ГЖХ, ИК- и ПИР спектрами, Состав жирных к исло т и рив еде н в .таб л, 2.Способ иллюстрируется следующимипримерами,П р и м е р 1. Суспензию 25 глиофильно высушенных клеток Я, шппезоСа Вв 625 мл (25-кратныйобъем ) рас тв ора хлороформ - метанол - 1,8 У.-ная соляная кислота(1 0; 21: 7 ), перемешивают 4, 5 ч и филь труют через пористый стеклянныйфильтр.Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. Полученные фильтраты объединяют, добавляют 540 мл хлороформа и 690 мл воды (до объемного соотношения растворителей в смеси 1034:1036:1035),смесь встряхивают 5 раз и центрифуг ирую т п ри 1 0000 8 в теч ение 7 мин,Некиюю Фазу отделяют и упаривают досуха (здесь и далее растворителиотгоняют на роторном испарителе при30 С и 20 мм рт,ст,). Остаток растсворяют в 30 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку, заполненную200 г сферона ОД 1000. Колонку последовательно промывают 2500 мо ацетонитрила, 2000 мл смеси ацетонитрил - изопропанол (5:1 ), Элюент, по5 1 лученный при промывании 1500 мл чистого изопропанола, упаривают досуха, остаток перекристаллизовываютиз 15 мл ацетонитрила, сушат в вакууме (здесь и далее сушку проводятопри 25-30 С при О, 2 мм рт. ст. ) и получают 129 мг липида А (5,16 мг/г сухих клеток) в виде бисфосфата с содержанием основ ногов ещес тв а 96, 4% .П р и м е р 2. Суспензию 11 глиофильно высушенных клеток Б, ппппезоСа Вв 550 мл (50-кратныйобъем) раствора хлороформ - метанол - 0,9%-ная соляная кислота (10:17:12) перемешивают 5 ч и фильтруют через пористый Фильтр. Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. Полученные Фильтраты объединяют, добавляют 300 мл хлороформа и 210 мл воды, смесь встряхивают 5 раэ и центрифугируют при 10000 8 в течение 7 мин, Нижнюю Фазу отделяют и упаривают досуха. Остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку заполненную 100 г сферона ОД 1000, Колонку последовательно промывают 1500 мл ацетонитрила, 1000 мл смеси ацетонитрил-изопропанол (4:1). Элюент, полученный при промьвании 1000 мл чистого изопропанола, упаривают досуха, остаток перекристаллизовьвают иэ 18 мл ацетонитрила, сушат в вакуумеи получают 66,4 мг липида А (6,04 мг/г . сухих клеток) в виде бисфосфата- с содержанием основного вешества 97,9%П риме р 3, Суспенэию 13 г лиофильно высушенных клеток Б. ппппезооСа Вв 400 мл (31-кратный объем) рас твора хлороформ - метанол - 1,5%-ная соляная кислота (10: :20:8) перемешивают 5 ч и фильтруют через пористый стеклянный фильтр.Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. Полученные Фильтраты объединяют, добавляют 320 мл хлороформа и 380 мл воды, смесь встряхивают 5 раз и центрифугируют при 10000 8 в течение 7 мин, Нижнюю Фазу отделяют и упаривают досуха, Остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку, заполненную 120 г сферона ОД 1000. Колонку последовательно промьвают 1800 мл ацетонитрила и200 мл смеси ацетонитрил - изопропанол 4:1 . Элюент, полученный при промывании55 25 30 35 1200 мл чистого изопропанола) унлрпвают досуха, остаток перекристаллиэоььвают иэ 25 мл ацетонитрил,сушат в вакууме и получают 77,9 мглипида А (5,99 мг/г сухих клеток)в виде бисфосфата с содержанием основного вещества 98, 2%,П р им е р 4. Суспензию 5 г лиофильно высушенных клеток БЬде 11 а Г 1 ехпег 2 А в 375 мл (25-кратнь 1 й избыток) раствора хлороформ - мета.нол - 1,8%-ная соляная кислота (0: : 21: 7) перемешивают 4, 5 ч и Фильтруют через стеклянный пористый Фильтр. Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 разаПолученные филь тра ты объединяют, добавляют 325 мл хлороформа и 415 мл воды, Смесь встряхивают 5 раэ и центрифугируют при 10000 д в течение 7 мин. Нижнюю Фазу отделяют и упаривают досухаОстаток растворяют в 10 мл ацетонитрила и раствор вносят в колонку, заполненную 100 г сферона ОД 1000. Колонку последова- . тельно промывают 1800 мл ацетонитрила и 1200 мл смеси ацетонитрила изопропанол (5:1), Элюент, полученный про промывании 1200 мл чистого иэопропанола, упаривают досуха, остаток перекристаллизовывают из 5, О мл ацетонитрила, сушат в вакууме и получают 15,1 мг (1,01 мг/г сухих клеток) липида А в виде биофосфата с содержанием основного вещества 95,1%.П р им е р 5. Суспензию 10 г лиофильно высушенных клеток БЬ, 11 ехпегх 2 А в 500 мл ( 50-к ра тный из быток) раствора хлороформ - метанол 0,9%-ная соляная кислота, взятых вобъемном соотношении 1 0:17;2, перемешивают 5 ч и фильтруют через стеклянный по рис тый Филь тр, Цикл оп е раций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. ПолученныеФильтры объединяют, добавляют 270 мл хлороформа и 190 мл воды. Смесь встряотделяют и упаривают досуха. Остаток растворяют в 10 мл ацетонитрила и . раствор вносят н колонку, заполненную 100 г сферона Ос 1000, Колонку последов атель но и ром ьв ают 18 00 мл ацетонитрила и 1200 мл смеси ацетонитрил - изопропанол (4:1). Элюент,полученный при промывании 1200 млчистого изопропанола, упариэают до70-75 28-33 65-70 25-28 МенееСледыИе обнаружено СледыНе обнаружено суха, остаток перекристаллизовывают из 5,0 мл ацетонитрилаи получают 19, мг липида А ,1,91 мг/г сухих клеток) в виде бисфосфата с содержанием основного вещества 96,675П р и м е р б, Суспензию 11 г лиофильно высушенных клеток БИ. Г 1 ехпег 2 А в 340 мл (31-кратный избыток) раствора хлороформ - метанол - 1,5 Е-ная соляная кислота (10;20:8) перемешивают 5 ч и фильтруют через Пористый фильтр, Цикл операций повторяют с отфильтрованными клетками еще 2 раза. Полученные Фипьтраты 15 объединяют, добавляют 270 мл хлороформа и 320 мл воды. Смесь встряхиВают 5 раз и центрифугируют при 10000 8 в течение 7 мин, Нижнюю фазу отделяют, упаривают досуха. Остаток 20 растворяют в 1 О мл ацетонитрила и Вносят в колонку, заполненную 100 г сферона ОД 1000. Колонку последовательно промывают 1700 мл ацетонитрила и 1200 мл смеси ацетонитрил:изо пропанол (4:1), Элюент, полученный при промывании 1200 мл чистого изопропанола, упаривают досуха, остаток перекристаллиэовывают из 5,0 мл аце" тонитрила и получают 21,8 мг липида 30 А (1,98 мг/г сухих клеток) в виде бисфосфата с содержанием основного вещества 971%.Формула изобретенияСпособ получения липида А из3 Г грам-отрицательных бактерий, включа.ющий лиофильную сушку бактериальныхклеток, гидролиэ липополисахарицасоляной кислотой, освобождение сырого продукта от водорастворимых примесей путем экстракции в двухфазнойсистеме, образованной смесью хлороформа, метанола и воды, а также обращеннофазную хроматографию, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения технологического процессаи повышения выхода целевого продукта,клетки экстрагируют три раза по 4,5 ч25-50-кратными объемами смеси хлороформ-метанол,9-1,8 Е-ная солянаякислота, взятых в объемном соотношении 10:(17-21):(7-1 2), объединенныйэкстракт разбавляют хлороформом и водой до установления в смеси равныхобъемов растворителей, нижнюю Фазуобразовавшейся двухфазной системыупаривают досуха, остаток хроматографируют на колонке со сферономОД000, колонку промывают ацетонитрилом и смесью ацетонитрила и изопропанола, взятыхв объемном соотношении (4-5):1, после чего изопропанолом вымывают липид А , которыйперекристаллизовывают из ацетонитрила. 2. Способ по и. 1, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что клетки грамотрицательных бактерий используют в или Б-форме.15,8+3,0 8,6+2,6 ММ Подстрочный индекс - количество атомов углерода в кислоте: количество двойных связей. Составитель Г. ОсиповТехред М. Ходанич Ко ррек то р Э. Лончак ова Редактор М. Недолуженко Заказ 2066 Тираж 306 Под п ис ноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 12 ОСи:о2 ОН-С б:0С 19 2Неиде нтифицированные жирные кислоты 9,4+0,3 3,8+0,5 14, 2+0,5 4,+0,2 30,8+1,1 11,910,4 9,0+0,315,1 ф.0,522,6+0,7 8,4+0,3 9,6+0,6 6,7+0,2