Способ определения микроколичеств днк

1/64, С 09 К5/00 ОПИСАН ИЗОБРЕТЕНИЯ СВМДЕТЕЛЬСТ 4381082/30-1318.02.8807,04.90, БюлЦентральный нрентгенорадиолинградский те(71 11- 13учно-иогичеснологич следовательий институтеский кий ЛеФо): (ИФ-ИФ, )1 С(х) = С,: п)(ИФ Изобре биохимииможет быт ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ ГКНТ СССР институт им, Ленсовета(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ДНК(57) Изобретение относится к биохимиии молекулярной биологии и может бытьиспользовано для контроля за содержанием ДНК в условиях низких концентраций полинуклеотида, в том числепри его выделении и очистке, в работах по радиобиологии при оценке повреждающих воздействий ионизирующегоизлучения, а также в медицине при диагностике некоторых видов заболеваний.Целью изобретения является повьппениечувствительности способа определениямикроколичеств ДНК при одновременномего удешевлении. Основа нового способа - использование нового флуоресцентного красителя 2 -2-(4-оксиФенил) "-5(б)-бензимидазолил -5(6) в (1-пипение относится к области молекулярной биологии и спользовано для контрол разинил)-бенэимидаэола в условиях,оптимальных для образования специФического комплекса этого красителя сДНК, Измерение интенсивности Флуоресценции (ИФ) проводят до взаимодействия красителя с анализируемой ДНК,после него и после добавки в ту жекювету раствора ДИК известной концентрации. Расчет искомой концентрации полинуклеотида осуществляют поФормуле где С - исходная концентрация стандартного раствора ДНК, мкг/мл; и разбавление исследуемой пробы в кювете, п - разбавление стандартного раствора ДНК в кювете;ИФ - интенсивность Фоновой Флуоресценции, ИФ, - ин: тенсивностьь Флуоресценции окрапенной пробы; Иф . - интенсивность Флуоресценции пробы после добавки стандартного р-ра ДНК. Предложенный метод позволяет определять содержание ДНК в растворах с концентрацией в 1,5- 2 раза ниже, чем известные способы, использующие коммерческие Флуоресцентные красители ДАФИ и Хехст. Благодаря достаточно высокой специФичности нового метода он может быть с успехом применен при анализе низких концентраций ДНК в биологических материалах, в частности в плазме крови, 5 табл.3 одержания ДНК в условиях низких конентраций полинуклеотида, в частноти, в радиобиологии при оценке пову й - 1 реждающих воздействий излучения, а также в медицине при диагностике некоторых видов заболеваний.,Цель изобретения - повышение чув 5 ствительности и удешевление способа определения микроколичеств ДНК.Основу предлагаемого спососба составляет использование нового Флуоресцентного красителя 2 -2-(4-оксифинил)-5(6)-бензимидазолил(6)-(1-пиперазинил)-бензимидаэола Формулы мщ г 1г ,0 15И МИ Н(1) в условиях, оптимальных для образова ния специфического комплекса данного красителя с ДНК (при рН ,1+0,6).флуоресцентный краситель (1) характеризуется= 350+2 нм и= 460+2 нм. Измерение интенсивности флуоресценции (ИФ) проводят до(ИФ ) и после (ИФ,) взаимодействия красителя (Хт) с анализируемым раствором ДНК, а также после добавки в кювету раствора ДНК (ИФ 2) известной концентрации, Расчет искомой концент-, 30 рации, мкг/мл, ДНК осуществляют по формуле Чистоту продуктов контролируют ме-тодом ТСХ на пластинах Бт 1 ц 2 о 1-67-254 где С - концентрация стандартнойстДНК, мкг/мл,п - разбавление исследуемойпробы в кювете измерения,и - разбавление стандартной2ДНК в кювете измерения;ИФ - интенсивность фоновой Флуоресценции;ИФ итенсивность Флуоресценциипробы, окрашенной (Т);ИФ - интенсивность флуоресцен 2ции пробы после добавкираствора стандартной ДНК.Предлагаемый метод позволяет определять содержание ДНК в растворахс концентрацией до 3 10 ф мкг/мл(нижняя граница чувствительности),что примерно в 1,5-2 раза ниже предела чувствительности для известныхФлуоресцентных красителей ДАФИ иХехст. В силу достаточно высокой специфичности красителя (Ъ) метод определения микроколичеств ДНКможет бытЬ использован при анализе .содержания ДНК в биологических материалах, в частности в плазме крови.П р и м е р 1, Синтез Флуоресцентного красителя (1) осуществляют посхеме в системах: А - хлороформ - метанол1 555652 Таблица 1 Проба Состав пробы ДИФ ИФ-Иф+ ст, ДНК (6,7 мкг/мл) 0,135 0,278 0,400 0,235 0,330 О,42 О 0,143 0,122 0,095 0,090 7,70 6,94 П р и м е ч а н и е. Разбавление проводят при и, = 53,5 и и = 54,5. Таблица 2 ИнтенКрасиЗначение интенсивности при конечной концентрации,мкг/мл сив 1,31 2,29 3,8410 э 1 О 10- 1 0 0,16 х 0,32 х 0,67 10 1 О .1 О 5,33 6,0 х тель ность 8,0 19,0 5,3 63 3,9 14,3 2,7 3,1 2,4 34,4 4,9 16,9,ДАФИ 12,8 0,111,2 018,6 1,1 13,2 13,9 0,5 1,2 11,3 11,6 0,.1 0,4 20,3 22,0 2,8 4,56,4 3,7 2,9 0211,2 11,2 17,5 ИФ Хехест ДИФ (1) ИФ,ДИФ 019,2 17 О,28,11,ных животных объемом 0,02-0,05 мл .без,какой-либо предварительной обработкивносят в стандартную кювету на 10 ммизмерения флуориметра, содержащую1,0 мл буфера (0,01 М трис, 0,01 Мтрилон Б, 0,1 М хлористый натрий. рН 8,1) и определяют интенсивностьфлуоресценции ИФ при Ярп = 350 нмщели п = 5 нм.рвгмстр = 460 нм 1 Ощели регистр = 15 нм. После этого добавляют 0,05 мл красителя (1), исходная концентрация 2 мкг/мл и измеряют ИФ , затем в эту же кювету добавляют 0,02 мл раствора ДНК тимуса 15крысы с известной концентрацией(3,7 мкг/мл) и определяют ИфРезультаты измерения опытов приведены в табл.5,Измерение концентрации ДНК в плаэме мышей предлагаемым способом позволяет выявить известный феномен снижения уровня ДНК после облучения.Минимальное количество ДНК, определяемое в этих. случаях в кювете,составляет для плазмы облученных мышей 0,372 мкг/мл, а для реперной ДНК0,066 мкг/мл. Использование изобретения обеспечит возможность осуществления быстрого, простого и экономичного анализа содержания ДНК в растворах с концентрациями в 1,5-2 раза ниже, чем при использовании наиболее чувствительных из известных флуоресцентных красителей,формула изобретения Способ определения микроколичеств ДНК, включающий обработку раствора полидезоксирибонуклеотида флуоресцентным красителем, определение интенсивности флуоресценции образующегося комплекса и сравнение ее с интенсивностью флуоресценции стандартного раствора ДНК, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повьппения чувствительности и удешевления анализа, в качестве красителя используют 2-2-(4-оксифенил)-5(6)-бенэимидаэолил 1-5(6) в (1 -пиперазинил)-бензимидазол, а реакцию с ДНК проводят при рН 7,5-8,7,1555652 О Таблица 3 Относитель ныйквантовый Проба фтКед Состав пробы Оптическая плотность при350 нм выход Хехст ДАФИХехест ДАФИ (1) Хехст ДАФН (1) 33,1 7,74917 400 1 э 91 2 з 00 2 з 67 66,4 59,5 2,11 2,29 3,36 Буфер +краситель 2 +0,125. мкг/мл ДНК 3 +0,246 мкг/мл ДНК 0,0065 16,5 0,0055 31,5 0,0065 44,8 0,0035 0,0040 0,0035 0,0030 0,0045 0,0035 Та блиц а 4 рн ИФ, отн,ед,БуФер + краситель + ДНК ЬИФ Буфер + краситель Таблица 5 ИФ,Проба Анализируемыйматериал Объем и, ипробы ИФ ИФ С2 вч плаъмырасчет по Формуле), мк г/мл 1 Плазма крови интактных мышей 0,02 53,5 54,5 28,6 1) 0,0 118,0 36,9 2 То же 0,02 53,5 54,5 27,3 105,0 113,5 33,2 0,02 53,5 54,5 19,5 67,75,8 Плазма кровиоблученных мышейТо же 19,9 19,6 Составитель О. Скуратовская Техред А.Кравчук Корректор Л,БескидРедактор Н.Бобкова Заказ 553 Тираж 529 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-изцательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина, 101 7,2 7,5.7,8 8,1 8,4 8,7 9,1 0,93 0,78 0,84 1,151,40 2,05 2,10 9,20 10,65 11,60 12,20.12,60 12,10 10,90 0,05 22,0 56,0 24,0 90,4 95,3 8,27 9,87 10,76 11,05 11,20 0,05 8,80