Способ определения аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных

(19) 33/48 1)5 С ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТТНРЫТИЯМ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСЙОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ндифосию АТФ рас/, В услоут по формуВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИМОЗГЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ поими го аль трации иьного ц итохондри фуги мето льие(71) Горьковский государственный медицинский институт им. С М,Кироваи Горьковский политехнический институт(57) Изобретение относится к биохи-. мии, а именно к способам определения АТФ в ткани мозга. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном расширении его функциональных возможностей, Цель достигается тем, что из ткани мозга выделяют митохондрии, определяют скорость использования Изобретение относится к био а именно к биоэнергетике, и мо быть использовано в эксперимен медицине для определения конце аденозинтрифосфата (АТФ) в тка га при комплексном исследовани циональной активности митохонд эффективности процессов окисли ного фосфорилирования в мозге. 2введенного АДФ (аденозиФата) АДФ/С, а концентрацсчитывают по величине АДФвиях нормоксии расчет ведле у=0,012471 фх+1,875228, где х -скорость использования введенногоАДФ (АДФ/й), а у - концентрация АТФПри определении концентрации АТФ вусловиях высотной гипоксии дополнительно измеряют высоту подъема Ь,времяпребывания животных в услвиях дефицита кислорода, а концентрацию АТФ рассчитывают по выражениюу=(,(Т)х+ц, где х - скоростьиспользования введенного АДФ (АДФ/Ч ф - рассчитанные по формуле (3) значения функций ф (С), зависящих от С; у - концентрация АТФ,Ц,(с)=А+А созА,С, где А,А ,Аэмпирические коэффициенты, значениякоторых зависят от П. Изобретениепозволяет быстро определить содержание АТФ в мозге и одновременно характеристику митохондрий - значениеАДФИ в условиях нормоксии и гипоксии, 2 з.п. ф-лы, 3 табл,Цель изобре тения - ускоренисоба при одновременном повьппенифункциональных возможностей.Способ осуществляется следуюобразом,Из мозга экспериментальныхных методом дифференциалрования выделяют мдом Лоури определяют содеробщего белка, Скорость потреблениякислорода в суспензии митохондрий измеряют полярографически в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 15 мМ КС 1,20 мМ КН РО, 10 мМ трис-НС 1 (рН 7,4),10 мМ пирувата + 5 мМ сукцината, после добавления 300 мкМ аденозиндифосфата (АДФ).При нормоксии по полученному зна,чению (АДФ/Г) определяют концентрацкоАТФ по формулеу=0,012471 фх + 1,875228, (1)где х - скорость использования введенного АДФ (АДФ/); , 15у - концентрация АТФЕсли требуется определить концентрацию АТФ в ткани мозга в условияхгипоксии, дополнительно измеряют высоту (или степень разрежения атмосферного давления) и время пребыванияв.условиях гиноксии (с), В этом случае концентрацию АТФ рассчитывают. поформуле:у=. р,(С)х + Ц, (С), (2)а ф, ф (1), зависящие от Т, рассчитывают по формуле(270 мм рт.ст.) табл. 3.Способ поясняется следующими примерами,П р и м е р 1 (для интактных животных в условиях нормоксии),1. Из ткани мозга интактного жи 40вотного (кролик) выделяют митохондрииметодом дифференциального центрифугирования.2 Определяют содержание общегобелка методом Лоури.453. Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза 0,25;КС 1 0,015; КН РО 0,02; трис-НС 10,01, В качестве субстратов окисленияиспользуют смесь сукцината (5 ммоль)и пирувата натрия (10 ммоль),504, Определяют скоростью фосфорилирования. добавленного АДФ (АДФ/Г.)полярографическим методом.В инкубационную среду добавляютмитохондриальную фракцию в объеме0,1 мл (в среднем содержание белка3,0-3,5 мг), Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве 300 мкмоль, после чего немедленнорегистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3), Утилизация в процессе дыхания добавленного АДФ вызывает состояние дефицита АДФ, что сопровождается последующим переходом в состояние5. На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФи рассчитывается скорость утилизацииАДФ в единицу времени (1 с), Скорость утилизации АДФ рассчитываетсяв мкмоль АДФ/мг белка/с АДФ/ . Экспериментально полученная величинаАДФ/Т равна 3,0 мкмоль АДФ/мг белка/с.б. Б формулу у=0,012471х ++ 1,875228 подставляют 3,0 и рассчитывают концентрацию АТФ/у, выраженную в мкмоль на 1 г ткани, соотнесенную к мкмоль АДФ/мг белка/су=0,0124713 + 1,875228=1,912641.Экспериментально установленнаяконцентрация АТФ 1,92+0,072, Ошибкаформулы составляет 0,42%,П р и м е р 2 (для интактных животных в условиях нормоксии),1, Из ткани мозга интактного животного (крысы) выделяют митохондрииметодом дифференциального центрифугирования.2. Определяют содержание общегобелка методом Лоури.3. Готовят среду инкубации следующего состава, моль: сахароза 0,25;КС 1 0,015; КНРО О, 42; трис-НС 10,01.Б качестве субстратов окисленияиспользуют смесь сукцината (5 ммоль)и пирувата натрия (10 ммоль).4. Определяют скорость фосфорилирования добавленного АДФ (АДФ/) полярографическим методом.Б инкубационную среду добавляютмитохондриальную фракцию в объеме0,1 мл (в среднем содержание белка3,0-3,5 мг). Затем проводят стандартную добавку АДФ в количестве300 мкмоль, после чего сразу же ре -гистрируют увеличение скорости потребления кислорода (переход в состояние 3). Утилизация в процессе дыханиядобавленного АДФ вызывает состояниедефицита АДФ, что сопровождается последующим переходом в состояние 45. На полярограмме измеряется время фосфорилирования добавленного АДФи рассчитывается скорость утилизации=5,8333595-4,6731473=1,1 Ь 02122.Значения функций ф,(30), ч",(30 ),экспериментальное значение АДФ/С(х)55подставляют в формулу (1) и рассчитывают у - концентрацию АТФ, выраженную в мгмоль на 1 г ткани, соотнесенную к мгмоль АДФ/мг белка/с,5 1549924АДФ в единицу времени (1 с), Скоростьутилизации АДФ рассчитывается вмкмоль АДФ/мг белка/с/АДФ/Т/.Экспериментально полученная величина АДФ/г. равна 1, 91 мкмоль АДФ/мгбелка/с.Ь. В формулу у=0,012471 х+1,875228подставляют 1,91 и рассчитывают концентрацию АТФ/С/, выраженную в10мкмоль/г ткани, соотнесенную к мкмольАДФ/мг белка/с,у=0,124711,91 + 1,875228==1,8990476,Экспериментально установленная 15концентрация АТФ 2,08+0,07, Ошибкаформулы составляет 8,77.,П р и м е р 3 (гипоксия Ь=7000 м,что соответствует атмосферному давлению 310 мм рт,ст.).Берут экспериментальное животное(кролик), помещают в проточную барокамеру и поднимают на высоту 7000 м,фВыдерживают на данной высоте 30 мин,Выделяют митохондрии и определяют 25АДФЙ полярографическим методом - см,в примере 1 п. 1, 2, 3, 4, 5. Экспериментально полученная величина АДФ/ равна 3,56 мкмоль АДФ/мг белка/с.Из табл, 1 выбирают значения коэффициентов АА 1,А, соответствующиефункциям Си С,.Рассчитывают значения ФункцийЧ"(с) и , по Формуле Ц),=А +А хАх соз (1=0,1), вместо С подставляют 3530 мин.Для расчета Функций Ч;(С) значениевремя пребывания животного в состоянии гипоксии- выражается в минутах.40Для Чос):Ао=1,6640566; Л,==1, 7060039,Экспериментально установленнаяконцентрация АТФ 1, 7110, 056. ОшибкаФормулы составляет 0,231.П р и м е р 4 (гипоксия 8000 м,атм.давл, 270 мм рт.ст,).1. Берут экспериментальное животное (кролик), помещают в проточнуюбарокамеру и "поднимают на высоту"8000 м.2, Выдерживают на данной "высоте"240 мин,3. Выделяют митохондрии и определяют АДФ/ полярографическим методомсм, в примере 1, п.1,2,3,4,5, Экспериментально полученная величина АДФЙравна 3,75 мкмоль АДФ/мг белка/с.4, Из табл. 2 выбирают значениякоэффициентов А 0,АА, соответствующие функциям Ч"0(г.) и ,(г).5. Расчитывают значения функций10(г.) и С по Формулер =А +А 0 соя в (1=0,1),Авместо Т подставляют 240 мин,Получаемдля Щ Ад=-0,2224712; А ==1,6853880.Экспериментально установленнаяконцентрация АТФ 1,700,066, ОшибкаФормулы составляет 0,86 Х,В табл, 3 отражено соответствиеданных, полученных по известномуспособу и изобретению.Изобретение позволяет сократитьв 2 раза время определения и одно(р,(с) 110,121 0,6105218 Таблица 3 АДФ/Г экспер АТФ эксперимкгмоль мент белка/с мгмоль/1 гткани АТФ, рассчи- ОтносиКол-во опытов Условия эксперимента танная попредлагаетельнаяошибкаформулы,Е мому способу Интактные 1,92+0,0722,08+0,07 1,912641 0,421,8990476 8,7 Кролики 3,000,1457Крысы 1, 910,07 э временно определить содержание АТФи величину АДФ/г., характеризующуюсвойства митохондрий моря, т,е, расширить функциональные возможностиспособа. Формула изобретения Способ определения аденозинтрифосфата в мозге экспериментальных животных путем забоя животного, выделения и гомогенизации мозга с последующим биохимическим исследованием гомогената, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа при одновременном повыше внии его информативности, из гомогената выделяют митохондрии, полярографически. определяют скорость потребления кислорода в присутствии аденозиндифосфата, а содержание адеНозинтрифосфорной кислоты рассчитывают по скорости использования аденозинтрифосфата. 252. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью определения аденозинтрифосфата при нормоксии, расчет ведут по формуле у=0,012471 х+1,875228,где у " концентрация аденозинтрифосфатах - скорость использования аденозиндифосфата; 3. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью определения концентрации аденозинтрифосфатав условиях высотной гипоксии, дополнительно определяют высоту подъема ивремя пребывания животных в условияхгипоксии, а содержание аденозинтрифосфата. рассчитывают по формулеу= Ср (С)х+ ф,(Е),где у - содержание аденозинтрифосфата;х - скорость использования аденозиндифосфата;время;ср,И),(,(1) - зависимые от времени функции,которые рассчитывают по форм уламТ (С)=А +А, саз (1=0,1),Агде А,А,А - эмпирические коэффициоенты, значения которыхзависят от высоты,Таблиц а 1=480Гипоксия270 мм рт,ст.1=15Гипоксия270 мм рт.ст,с=30Гипоксия270 мм рт, ст,г.=60Гипоксия270 мм рт. ст.с=240 1, 71+0, 056 1, 7060039 О, 23 3,56+0, 17 20 6,34 2, 944+0, 17 1, 85+0, 080 1, 732743 1, 94+0, 05 1, 9621754 1, 14 2,50+0,12 18 18 1,91+0,065 1,9012985 0,46 3,15+0,29 1, 45+0,080 1, 4801008 2, 08 3,02+0,16 1,63+0,080 1,6744151 2,72 2,73 ф 0,18 19 1, 6710, 029 1, 8725512 12, 1 3,74 ф 0,23 3,75+0,29 1,70+0,066 1,6853880 0,86 16 Составитель НГуляеваРедактор Н.Киштулинец Техред Л.Сердюкова Корректор Т.Палий Заказ 244 Тираж 511 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101