Способ определения качественного состава внеклеточных протеолитических ферментов бацилл

(51) 4 С 12 И 9/52, С 01 (С 12 Х 9/52, С 12 7/26//1:07) ТЕТ СССРИ ОТКРЫТИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИ Е ИЗОБРЕТ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(7 1) Институт биохимии АН ЛитССР(56) Ечегу Р. ЯиапСдгаг 1 че шеазигшепс оЕ ргогеазе асгидГез 1 п я 1 аЪро 1 уасг 1 ашЫе яе 1 е 1 есггорЬогеягашз. - Апа 1 у. ВдосЬпа. 1981,р. 116-519.Жеребцов Н,А., Щебыкина Л. Б. Исследование протеолитического комплекса микромицета РЬгориз рурпаизР 1-8. - Прикладная биохимия, микробиол. 1983, 19/2/, с. 226-231.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВЕННОГОСОСТАВА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХФЕРМЕНТОВ БАЦИЛЛ(57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к определениюкачественного состава протеиназ, и может найти применение в микробиологической промышленности, техническоймикробиологии и генной инженерии приселекции штаммов, синтезирующих нужный набор внеклеточиых протеиназ. Цель изобретения - сокращение времени определения состава протеиназ и упрощение известного способа, включающего, выращивание чистой культуры микроорганизмов на питательной среде, разделение выделяемых ферментов путем электрофореза с последующим выявлением Ферментов по полосам гидрализа на индикаторной пластине. Выращивание бацилл ведут на молочно-агарозной среде до появления зон просветления молока, образованных первичными колониями бактерий, а электрофорез ферментов ведут из дисков среды, отобранных из зон просветления молока. Локализацию ферментов выявляют на индика"й торной молочно-агарозной пластине по зонам просветления молока. Для, определения состава ферментов парал- лельно используют индикаторные пласти- С тинки с ингибиторами прбтеиназ - о-фенантролином (0,5 мг/мл), ингибитором 8 металло-протеиназ и фенилметансульфонилфторидом (0,5 мг/мл) - ингибитором сериковых протеиназ. Предложенный способ упрощает определение состава ферментов и сокращает время определения от 3-5 сут до 5-20 ч. 1 з.п. Ф-лы, 2 ил.132661Изобретение относится к микробио-,логии, а именно к способу определения качественного состава протеолитических Ферментов, и может быть применено в микробиологической промышленности, технической микробиологии игенной инженерии при селекции штаммов, синтезирующих нужный набор внеклеточньм протеиназ. 1 ОЦель изобретения - упрощение исокращение времени определения состава внеклеточных протеолитических Ферментов (ВПФ),На фиг. 1 изображено разделениепротеолитических ферментов путемэлектрофореза на полиакриламидном геле (ПААГ) из дисков, взятых из зоныпросветления, где А - чашка Петрис молочно-агарозной средой; видны две Пколонии с зонами просветления;. Б -аппарат электрофореза с нанесеннымидисками; В - индикаторные пластинкипосле инкубации с ПААГ; 1 - колониябацилл; 2 - зона просветления молока; 253 - диск, взят из зоны просветления;4 - разделительный ПААГ; 5 - концентрирующий ПААГ; 6 - индикаторная молочно-агарозная пластинка; 7 и 8 - зоныпросветления молока на индикаторнойпластинке, соответствующее месту наличия разных протеиназ в ПААГ; 9 - выявление сериновой протеиназы на индикаторной пластинке с о-Фенантролином;10 - выявление металло-протеиназ наиндикаторной пластинке с Фенилметан 35сульфонилфторидом (ФМСФ); 11 - индикаторная пластинка без ингибиторов.На Фиг. 2 изображена пластинка молочной агарозы без ингибиторов, где 1дорожка - протеазы ВасЫ 1 ця яцЪх 1 яСят 4; 11 дорожка - протеазы Вас 11 цяЬцгюдепяхя 203; 111 - дорожка - отсутствуют протеазы Вас 111 ця яцЬ 1 хяЯМУ 512; 1 Ч дорожка - протеазы транс 45форманта Вас 11 ця яцЪх 1 я 203. 20.При росте микроорганизмов на.молочной среде вокруг колонии образуютсязоны просветления молока - знак выделения из клеток внеклеточных протео 50лнтических Ферментов (ВПФ) . Из этойзоны вырезают диск и кладут в аппаратдля электрофореза, и под действиемэлектрического тока ферменты мигрируютиз диска в ИААГ. Их локализация и количестко выявляются при помощи молоч 55но-агарозной пластинки: ферменты дифундируют из ПААГ в молочную агарозуи просветляют молоко. Параллельные ин 5 2дикаторные пластинки с ингибиторами позволяют. точно определить состав ферментов (фиг. 1) .П р и м е р 1, КультУРУ Вас 11 ця яцЬд 1 я, Вас 11 ця СЬцгщепяхя, выращивают на молочно-агарозной среде (15 г агарозы, 450 мл дистиллированной воды, 150 мл обезжиренного молока) 18-22 ч. Вокруг колоний (Фиг. 1, А, 1) образуются зоны просветления молока (фиг. 1, А,2) из которых вырезают диски диаметром 7 мм, толщиной 1 мм (фиг. 1, А, 3). Используют стандартный аппарат электрофореза на гелевой пластинке (фиг, 1,Б), После полимериэации нижней разделительной части геля (фиг, 1, Б, 4) концентрация ПААГ 77, РН 8,9 диски размещают над разделительным гелем и заливают 2,87-ным ПААГом (РН 6,7), образуя верхнюю часть (фиг. 1, Б, 5).Электрофорез проводят известным методом при О С; электродный буфер - 0,045 М; трис-глинциновый, РН 8,3, Время электрофореза 6 ч (1 ч 10 мА;100 В и 5 ч 30 мА, 220 В); эа это время происходит достаточно четкое разделение ферментов.Идентификацию ферментов проводят также известным методом. Пластйнку ПЛАГ после электрофореза накладывают на индикаторную пластинку толщиной 2 мм, сделанную из молочной агарозы такого же состава, как и среда выращивания микроорганизмов для дисков (Фиг, 1, В, 11). В зависимости от ожидаемого количества и активности Ферментов пластинки в контакте выдерживают 15 ч при 4 С (если ожидается высокая активность) или 3 ч при 37 СС (если активность невысокая). После инкубации ПААГ пластинку снимают и она может быть использована вторично, только необходимо увеличить экспозицию контакта. Индикаторную пластинку фиксируют 10 мин в 103-ном растворе трихлоруксусной кислоты.Одновременно делают электрофорез из трех параллельных дисков, взятых из зоны просветления одной колонии. Раздельные белки из одного диска служат контрольной полосой для выявления общего числа протеолитических фер. ментов (фиг.1, В, 11). Две другие полосы отрезают и накладывают: одну на индикаторную пластинку с ингибитором металло-протеиназ о-фенантрилином (0,5 мг/мп) для выявления сериновых3 13протеиназ (фиг. 1, В, 9); вторую - наиндикаторную пластинку с ингибиторомсериновых протеиназ фенилметансульфонилфторидом (0,5 мг/мл) для выявленияметалло-протеиназ (Фиг,1, В, 10). Наличие ферментов определяют по зонампросветления индикаторной молочноагарозной пластинке (см, схему нафиг. 1) .П р и м е р 2. Сравнение состава1протеиназ, синтезируемых клеткамив отдельных колониях Вас 111 цв вцЬг 11 гз Сяг 4 и Вас 111 цв ГЬцгдп 8 гепвгв203 (фиг. 2) .Клетки Вас 111 цв в 1 Ьс 111 з Сяг 4 иВасг 11 цв гЬцг 1 п 81 епв 1 в 203 выращиваютна молочно-агарозной среде (15 г агарозы, 450 мл дистиллированной воды,150 мл обезжиренного молока) 22 ч,Вокруг колоний образуются зоны просветления молока, из которых вырезают диски диаметром 7 мм и толщиной1 мм. Используют стандартный аппаратэлектрофореза на гелевой пластинке,После полимеризации нижней разделительной части геля (концентрация полиакриламида 7 Е, рН 8,9), дискиразмещают над разделительным гелем изаливают 2,8 Е-ным ПЛАГом (рН б,7), образуя верхнюю часть.Электрофорез проводят известнымметодом при 0 С; электродный буфер -0,045 М трис-глициновый (рН 8,3),Время электрофореза б ч (1 ч 10 мАи 5 ч 30 мА на пластинку),Идентификацию Ферментов проводятс помощью молочно-агарозной индикаторной пластинки. Пластинку ПААГ послеэлектрофореза накладывают на индикаторную пластинку толщиной 2 мм, сделанную из молочной агарозы такого жесостава, как и среда выращиваниямикроорганизмов. Пластинки в контактевыдерживали 4 ч при 37 С, визуальнонаблюдая за появлением зон просветления молока, после чего индикаторнуюпластинку фиксируют 10 мин в 107.-номрастворе трихлоруксусной кислоты.Для выявления типа протеиназ (металло- или сериновые) одновременноделают электрофорез из трех параллельных дисков, взятых из зоны просветления одной колонии, ПААГ послеэлектрофореза разрезают и накладываютна три параллельные индикаторные.пластинки. Первая - молочно-агарознаяиндикаторная пластинка без ингибиторов, которая служит для выявления2 б 6154 30 35 40 45 50 форез дисков донора (Вас 111 цв Тпцгдп 8 хепвдв 203, фиг. 2, 11 дорожка) и.реципиента (Васг 11 цв вцЬг 111 в ЯМУ 512,5 10 15 20 25 всех протеиназ; вторая - молочно-агарозная индикаторная пластинка с ингибитором металло-протеиназ о-фенантролином (0,5 мг на 1 мл молочно-агарозного геля) для выявления сериновых протеиназ; третья - молочно-агарозная индикаторная пластинка с ингибитором сериковых протеиназ фенилметилсульфонилфторидом (0,5 мг на 1 мл молочноагарозного геля) для выявления металло-протеиназ. Получено, что Васг 11 цв вцЬгг 11 в Сяг 4 при росте выделяет в среду сериновые и металло-протеиназы (фиг. 2, 1 дорожка). Вас 111 цв гпцгп- ядепвв 203 при росте выделяет четыре различающиеся по подвижности в ПААГ протеиназы (фиг. 2, 11 дорожка); две металло-протеиназы дают большие зоны просветления и одна с меньшей подвижностью дает незначительную зону просветления; небольшую зону дают сериновые протеиназы, оказывающие наибольшую подвижность, и этим они отличаются от сериковых протеиназ син- тезируемых клетками Вас 111 цв вцЬг.11 хв С 8 г 4,П р и м е р 3. Определение экспрессии клонированного гена металлопротеиназы Васг 11 цз гЬцг 1 п 81 епвдв 203в клетках Васд 11 цв зцЬг 111 в ЯМУ 512 по составу протеиназ,ДНК Васг 11 цв гЬцг 1 п 81 епв 1 з 203 обрабатывают рестриктазой Бац ЗА до неполной рестрикции и проводят лигирование с плазмидой рМХ 39, обработанной рестриктазой ВапН 1, После лигирования проводят трансформацию Вас 11- 1 цв зцЬгг 11 з ЯМУ 512 ргог , Отбирают трансформанты, устойчивые к эритромицину (плазмидный маркер) и образующие зоны просветления на молочной среде (экспрессия клонированного гена) .В связи с тем, что вокруг колоний трансформантов образуется слабо выраженная эона просветления, трансформанты пересеивают на молочную агарозу и из зон просветления вырезают диски и проводят электрофорез.Электрофорез и выявление протеиназ по зонам просветления на индикаторной молочно-агарозной пластинке с применением ингибиторов протеиназ проводились аналогично примеру 1. В качестве контроля проводят электро 5 132661 фиг, 2, 111 дорожка), При электрофорезе диска трансформанта 203.20 видна зона просветления, соответствующая одной иэ металло-протеинаэ донора. 5Предлагаемый способ определения состава протеолитических ферментов, выделяемых при росте клетками одной колонии микроорганизмов, по сравнению 10 с прототипом не нуждается в выращивании чистой культуры, с последующими пересевами в жидкую среду, а также выделении белковых препаратов иэ надосадочной жидкости для проведения 15 электрофореза белков и индикации протеолитических ферментов. Кроме того, не требуется многостадийность приготовления проб.20Преимущество способа заключается в том, что он позволяет одновременно изучать неограниченное число первичных после трансформации, мутагенеза или генно-инженерных операций колоний,25 упрощает определение состава ферментов и сокращает время от 3-5 сут до 3-20 ч. 5 6 формула изобретенияСпособ определения качественного состава внеклеточных протеолитических ферментов бацилл, включающий выращивание микроорганизмов на питательной среде, разделение выделяемых микроорганизмами ферментов путем злектрофореза с последующим выявлением Ферментов по полосам гидролиза на индикаторной пластинке, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени определения состава протеолитических ферментов, выращивание микроорганизмов проводят на молочно-агарозной среде до образования зон просветления молока, а электрофореэ ферментов ведут из дисков среды, выделенных из зон просветления молока, образованных первичными колониями микроорганизмов, с использованием в качестве индикаторной - молочно-агарозной пластинки.2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью определения типа протеиназ, в индикаторную пластинку вносят ингибитор металлоили сериновых протеиназ1326615Составитель В.Соина Редактор Н.Киштулинец Техред А.Кравчук Корректор М.Пожо Заказ 3248/21 Тираж 499 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, гУжгород, ул.Проектная, 4