Способ получения глюкоамилазы и белкового корма

(54) ИЯ ГЛЮКОпредусмат"ирование рива прод подс д 13 лзя сого органиэечдядае в ма в куль тили ОСУДАРСТВЕННЬИ КОМИТЕТ СССР(56) 1. Авторское свидетельство СССР Р 507634, кл. С 12 0 13/06, 1973.2. Авторское свидетельство СССР по заявке В 3345896/28-13, кл. С 12 И 9/34, 1981.3. Авторское свидетельство СССР В 997455, кл. С 12 Н 9/34, 1981. 57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧ ЗЫ И БЕЛКОВОГО КОРМА щий глубинное культ цента из рода Аярег вом культуры дрожже да БассЬаготусея се уральную жидкость и 2 И 9/34//С 12 Р 39/О цию остаточных сахаров дрожжами, отличающийсятем, что, с целью создания безотходного производства, снижения себестоимости и улучшения качества целевого продукта, а также повышения выхода белкового корма, подсев дрожжей осуществляют в стационарной фазе развития продуцента, причем перед подсевом в культуральную жидкость добавляют фосфорное, азотное питание, рН корректируют до значения 3,5-6,0 и после совместного культивирования при аэрации в течение 1 О"15 ч ферментный раствор и биомассу высушивают отдельно.2. Способпо п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качестве подсеваемого дрожжевого микроорганизма используют дрожжи иэ рода СапйЫа3. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что фосфорное и/или азотное питание осуществляют добавлением 1 ОХ-ного стерильного раствора диаммонийфосфата нли аммиака.10 25 30 35 40 45 50 55 Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения ферментных препаратов глюкоамилаэы и белкового кормового продукта в условиях безотходного производства.Известны способы интенсификации технологических процессов при производстве продуктов микробиологичес,кого синтеза путем совместного культивирования микроорганизмов. Например, известен способ получения лизина, который предусматривает подсев в культуральную жидкость с остаточной концентрацией сахаров около 3% на логарифмической стадии роста продуцента не ассимилирующих лизин микроорганизмов Тг 1 сЬоярогоп СцСапецш Мили СапйЫа ггордса 1 гя в количестве 0,1-1,2 вес.% (. 1(Однако микроорганизмы подсевают в культуральную жидкость беэ учета оптимальных параметров их развития, не учитывается потребность подсеваемых микроорганизмов в дополнительном минеральном азотном(ифосфорном питании, способствующем ускорению роста и более полному условию остаточных сахаров. Кроме того, подсев микроорганизмов в логарифмической фазе тормозит биосинтез ферментов.Известен также способ получения амилолитических ферментов, предусматривающий совместное выращивание продуцента АярегдИ 1 ця огугае и дрожжей ЗассЬагошусея .сегечхяае при рН 5,3-3,5 в течение 20-40 ч23.Способ не позволяет получить амилолитические ферменты высокой активности, так как при совместном культивировании с одновременным засевом грибов и дрожжей последние, имея бо-. лее короткий цикл развития, быстрее и в большем количестве потребляют углеводы, а биосинтез глюкоамилазы не обедненной питательной среде замедляется. Способ не предусматривает утилизации остаточных непотребленных сахаров.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ получения концентрированных ферментных препаратов, в том числе глюкоамилазы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента из рода Аярегд 11 ця с подсевом культуры дрожжевого организма вида БассЬагошусея сегечдяае в культуральную жидкость и утилизацию остаточных сахаров дрожжами. Культивирование ведут при начальном рН 3,8-5,6 температуре 30-35 С в течение 72 о144 ч до получения активности по глюкоамилазе 20-200 ед./мл. Подсев дрожжей осуществляют после отделения биомассы гриба, срабатывание ведется в анаэробных условиях в течение 24 ч до содержания остаточных сахаров 0,5-1,0% и концентрации спирта 3-5 об.%. Затем осуществляют концентрирование ферментно-спиртовой смеси ультрафильтрацией или выпариванием до получения концентрированного ферментного препарата и спирта ГЗ."(.Способ не позволяет получить высокого содержания белка в биомассе из-за наличия в культуральной жидкости после сбраживания остаточных сахаров (0,5-1%).Применение способа .на заводах микробиологической промьппленности неэкономично. Цель изобретения - создание беэотходного производства, снижение себестоимости и улучшение качества целевого продукта, а также повьппение выхода белкового корма. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глюкоамилазы и белкового корма, предусматривающему глубинное культивирование продуцента из рода Аярегх 11 ця с подсевом культуры дрожжевого организма вида ЯассЬаговусея сегечдяхае в культуральную жидкость и утилизацию остаточных сахаров дрожжами, подсев дрожжей осуществляют в стационарной фазе развития продуцента, причем перед подсевом в культуральную жидкость добавляют азотное и фосфорное питание, рН корректируют до значения 3,5-6,0 и после совместного культивирования при аэрации в течение 10-15 ч ферментный раствор и биомассу высушивают отдельно. В качестве подсеваемого дрожжевого микроорганизма используют дрожжи из рода СапйЫа.Фосфорное и/или азотное питание осуществляют добавлением 10%-ного стерильного раствора диаммонийфосфата или аммиака.097673 30 35 40 45 5 ц 55 э 1Способ осуществляется следующим образом.Продуценты глюкоамилазы из рода Аярег 811 ця культивируют на концентрированных питательных средах в аэробных условиях при 30-35 С и начальном значении рН 4,8-6,0 в течение 84-150 ч. За 10-50 ч до максимального образования глюкоамилазы на стационарной фазе развития продуцента в культуральную жидкость вводят стерильный раствор, содержащий источники азота и Фосфора из расчета ожидаемого выхода воздушно-сухой юиомассы подсеваемых микроорганизмов по отношению к остаточным сахарам (соотношение остаточных сахаров, азота и фосфора рассчиты" вают по содержанию их в биомассе подсеваемых микроорганизмов), проверяют рН и доводят его значение до 3,5-6,0 добавлением стерильного раствора кислоты или щелочи. Подсевают культуру микроорганизмов, утилизирующих остаточные сахара, например дрожжи рода Сапс 1 Ыа или БассЬагошусея, и проводят совместное культивирование при оптимальных условиях для развития дрожжей, т.е. при 30 о35 С,подаче воздуха 0,5 - 1,5 м /ммин до прекращения размножения дрожжей (10-50 ч). Из полученной культуральной жидкости отделяют биомассу, например фильтрацией, и сушат раздельно ферментный раствор, содержащий глюкоамилазу, и биомассу. П р и м е р 1. Продуцент глюкоамилазы Аярегдх 11 ця пЦег Т-ЗЗ.куль тивируют в колбах на качалке прио33 С в 100 мл концентрированной питательной среды, содержащей источники углеводов, азота, фосфора и биостимуляторы, при начальном значении рН 5,4. После 120 ч роста (за 30 ч до максимального накопления глюкоамилазы) активность глюкоамилазы в культуральной жидкости составляет 110 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 4,5%, сухие вещества (СВ) 8,2%, рН 3,3. В полученную культуральную жидкость на стационарной фазе развития продуцента добавляют дополнительное азотное и Фосфорное питание в виде 10%-ного стерильного раствора диаммоний фосфата в количестве 0,9% соли из расчета ожидаемого выхода воздушно-сухой биомассы дрожжей 45% от РВ, содержащей 3,5% фос 5 О 15 20 25 фора и 8% азота, доводят значение рН до 4,8 добавлением стерильного раствора щелочи, вводят посевной материал дрожжей БассЬагошусея сегеч 1 яае Т, выращенный на сусле, и проводят совместное культивирование в течение 30 ч при 30 С и подаче воздуха 1;5 м /ммин до прекращения размножения дрожжей.Полученная культуральная жидкость имеет ГлС 105 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 0,26%, СВ 4,8%. Из полученной культуральной жидкости от.деляют биомассу фильтрованием и из фильтрата после высушивания его на распылительной .сушилке с наполнителем Ма.,804(150% по СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 780 ед./г, После высушивания биомассы получают 4,3 г/100 мл сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 44,1%.П р и м е р 2 Продуцент глюкоамилазы Аярегдх 11 ця пЦег Ткультивируют при тех же условиях,что в примере 1. В культуральную жидкость с той же характеристикой, что в примере 1, вводят посевной материал дрожжей Бассйагошусея сегечяае раса 14 и проводят совместное культивирование при тех же условиях, что в примере 1.Полученная культуральная жидкость имеет 1 12 ед,/мл, РВ 0,22%, СВ 4,3. После отделения биомассы и сушки фильтрата с наполнителем ИаС 1 (150% по СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с ГлС 820 ед./г. После высушивания биомассы получают 4,4 г/100 мл сухого белкового корма с содержанием сырого протеина43,9%,Л р и м е р 3. Продуцент глюкоамилазы Аярег 811 ця аюашог 1 Р - 122культивируют в биолафите на концентрированной питательной среде при35 С и начальном значении рН 4,8.оПосле 67 ч. роста (за 30 ч до максимального накопления глюкоамилазы) в КЖ ГлС 175. ед,/мп, РВ 4,7%,СВ 5,0%, рН 2,9. Полученную культуральную жидкость до подсева обрабатывают так же, как в примере 1,вводят посевной материал дрожжейЯассхагошусея сегечядае раса ХП,выращенных на сусле, и проводятсовместное культивирование в течение 30 ч при 32 С и подаче 0,5 м /мо.жидкость имеет ГлС 168 ед./мл,РВ О 9 2; 7, СВ 3, 97, Биомассу определяют Фильтрацией и фильтрат сушатна распыпительной сушилке с наполнителем Иа ЛО,(200% по отношениюк СВ). Полученный препарат технической глюкоамилазы имеет ГлС950 ед./г, После высушивания биомассы получают 4,1 г сухого белкового корма с содержанием сырогопротеина 43,2%.П р и м е р 4. Продуцент глюкоамилазы Лзр. пЦег Ткультивируют в тех же условиях, что в примере 1,. После 140 ч роста (за 10 .чдо максимального накопления глюкоамилазы) культуральная жидкостьхарактеризуется активностью глюкоамилазы 115 ед,/мл, РВ 5,2%,СВ 7,97, рН 3,1. Полученную культуральную жидкость обрабатывают,как в примере 1, после чего вводятпосевной материал дрожжей СапЙЫаСгор 1 са 11 з С 11-4, выращенных на сусле, и культивируют совместно в теочение 10 ч при 35 С и подаче воздуха 1,5 м/м мин до прекращенияразмножения дрожжей. Полученнаякультуральная жидкость имеет активность глюкоамилазы 115 ед./мл, остаточного сахара (по РВ) 0,35%,СЙ 4,6%. Культуральную жидкостьфильтруют и из Фильтрата путем высушивания его на распылительной сушилке с добавлением наполнителяМа БО(150% по отношению к СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 850 ед./г.Биомассу высушивают и получают 4 г(из 100 мл культуральной жидкости)сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 437,П р и м е р 5, Продуцент глюкоамилазы Азр. аыашогь. Акультивируют в колбах на качалке при 30 С в 100 мл концентрированной среды, содержащей те же источники питательных веществ, что в примере 1, но при начальном значении рН 6,0.После 74 ч роста (за 10 ч до максимального образования глюкоамилазы) на стационарной фазе развития продуцента культуральная жидкость имеет следующую характеристику: активность глюкоамнлазы 128,8 е,/мл, остаточные сахара (по РВ) 6,67.,СВ 10,87, рН 5,1. Перед подсевом дрожжей в культуральную жидкость вводят 1,37 диаммонийфосфата в виде 107.-ного стерильного раствора (из расчета, как в примере 1), доводят рН до 6,0 и в стерильных условиях засевают посевным материалом дрожжей СапйЫа 1 ь.11 з, предварительно выращенных на суспе. Совместное культивирование продолжают при 33 С и подаче воздуха 1,0 м/м" мин до прекращения размножения дрожжей (10 ч).Получают культуральную жидкость с активностью глюкоамилазы 136 ед./мл, содержанием остаточного сахара (по РВ) 0,257 и СВ 4,8%. Биомассу отделяют Фильтрованием, высушивают и получают 4,2 г (из 100 мл культуральной жидкости) воздушно-сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 44,87. Фильтрат культуральной жидкости высушивают на распыли- тельной сушилке с добавлением наполнителя ИаС 1 (1007 по СВ) и получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 960 ед./мл.П р и м е р 6. Продуцент глюкоамилазы Азр. аыащог 1 Г - 122 выраощивают при 35 С в Ферментере полезной емкостью 35 л на концентрированной питательной среде, содержащей те же источники питания, что в примере 1 но при начальном значении рН 4,8. После 67 ч роста продуцента в стационарной фазе развития его (за 50 ч до максимального накопления глюкоамилазы) в культуральной жидкости накапливается 168,8 ед, /мл глюкоамилазы, а содержание остаточных сахаров снижается до 4,627, СВ составляет 10,27, рН 2,95. Перед подсевом дрожжей в ферментер вводят раствор аммиака 0,567 (из расчета, как в примере 1) и доводят рН до 3,5 раствором ортофосфорной кислоты. В культуральную жидкость в стерильных условиях подсевают посевной материал дрожжей СапйЫа .гЬогеае, выращенных на сусле. Совместное культивирование проводят при 30 С и подаче воздуха 0,5 м /м, хмин в течение 50 ч до прекращения размножения дрожжей. Получают культуральную жидкостьс активностью глюкоамилазы 185 ед./мли содержанием остаточных сахаровСоставитель Е. ВорьбьеваТехред И.Асталош Корректор А. Тяско Редактор Л. Веселовская Заказ 4152/24 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 7 109 отделяют Фильтрованием и сушат, а фильтрат очищают и концентрируют с последующим высушиванием на распыли- тельной сушилке с добавлением наполнителя ВаС 1 (1003 по СВ). Получают препарат очищенной глюкоамилазы с активностью 4750. ед./мл и 45 г воздушно-сухого белкового корма (из 1 л . культуральной жидкости) с содержанием сырого протеина 42,8 Х, 10П р и м е р 7 (контроль) Ироду- цент глюкоамилазы Азр. ачашог Ркультивируют в колбах на качалке при 35 С в 100 мл концентрированной питательной среды, содержащей источники5 углеводов, азота, фосфора и стимуляторы роста. В середине логарифмической Фазы развития продуцента (45 ч ферментации) культуральная жидкостьимеет следующую характеристику: актив ность глюкоамилазы 105 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 4,8 Е, СВ 9,77., рН 2,9. В культуральную жидкость вносят посевной материал дрожжей СапйЫа сгордса 1 з СКи осу ществляют совместное культивирование при 31 С и аэрации 1,0 мз /мз мин, поддерживая рН среды 6,5. Процесс культивирования продолжают до минимального содержания сахаров в куль 673 8туральной жидкости (в среднем 112 ч). Полученная культуральная жидкость имеет глюкоамилазную активность88,2 ед,/мл, остаточные сахара (по РВ) 1,253, СВ 5,77. Иэ культуральной жидкости выделяют биомассу, а Фильтрат уларивают до содержания сухих веществ 32,97., а затем сушат на распылительной сушилке. В процессе высушивания препарат налипает настенки сушилки.Таким образом, используя предла"гаемый способ получения глюкоамилазы и белкового корма, можно, получить порошкообразные ферментные препаратытехнической глюкоамилазы при культивировании высокоактивных продуцентов на концентрированных питательныхсредах товарного видаф создать безотходное производство препаратовглюкоамилазы; улучшить качество препаратов глюкоамилазы по гигроскопичности, получить белковый кормовой продукт, по содержанию сырого протеина соответствующий ВВКИУ снизитьсебестоимость препаратов глюкоамилазы на 10-15 Ж.Ожидаемый годовой экономическийэффект от внедрения предлагаемогоспособа составит 3582,36 тыс,руб.