Способ и. и. дзержинской прогнозирования течения воспалительного процесса

3 СОВЕТСНИХЦИАЛИСТИЧЕСКИХСПУБЛИК А А 61 В 1 О/00 ЕТЕНИЯ ЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(7) 2-й Московский ордена Ленинагосударственный медицинский институнм. Н.И.Пирогова(56) 1. Воробьева А.И Лорис Ю.И.Руководство по гепатологии, М.,19768-7 .2. Авторское свидетельство СССРпо заявке У 3471980/13,кл. А 61 В 1 О/00, 1982,(57) Способ прогнозирования теченивоспалительного процесса путем пос 80.109 325 новки реакции розеткообразования снейтрофилами, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью снижения травматич"ности способа, у пациентов беруткровь, наслаивают на градиент фиколлт уротраста с плотностью 1,073 - 1,083 г/мпдалее выделяют фракцию нейтрофилов,инкубируют ее со взятыми в равныхчастях 2,5%-ным раствором спонтанных ,с, эритроцитов барана и 2,5%-ным раствором комплементарных эритроцитов человека, затем определяют число образовавшихся тотальных Д-нейтрофилов ипри увеличении их относительно нормыв 8-19 раз прогнозируют острый воспалительный процесс, а при увеличенииД-нейтрофнловв 3-7 раз относительнонормы прогнозируют хроническую форму а- течения воспалительного процесса, 1093325Изобретение относится к медицине иможет быть использовано для пронозирования течения воспалительного про"цесса.Лейкоциты играют основную роль в 5противомикробной защите, Дефекты влюбом из звеньев антимикробных систем нейтроФилов ведут к заболеваниям,характеризующимся частыми повторнымиинфекциями 11.1 ОИзвестен способ дифференциальнойдиагностики острых и хронических воспалительных процессов, заключающийсяв том, что разработан метод выделенияпопуляции предшественников гранулоцитарного ряда позволяющий диагностировать острый и хронический воспалительный процесс 121Недостатками способа являются дли-.тельность исследования,травматичность 2 Отак как берется пунктат костного мозга.Целью изобретения является снижениетравматичности способа, позволяющеговыделит" популяпию клеток, отражаю" 25щую барьерную функцию костного мозгаи изучение ее диагностической ценностиПоставленная цель достигается тем,что согласно способу прогнозирования ЗОтечения воспалительного процесса путем постановки реакции розеткообраэования с нейтрофилами, у пациентаберут кровь, наслаивают ее на градиент фиколл-уротраста с плотностью51,073-1,083 г/мл, далее выделяютфракцию нейтрофилов, инкубируют еесо взятыми в равных частях 2,57-нымраствором спонтанных эритроцитов и2,53-ным раствором комплементарныхэритроцитов человека, затем определяют число образовавшихся тотальныхД-нейтрофилов н при увеличении их от"носительно нормы в 8-19 раз прогнозируют острый воспалительный процесс, 45а при увеличении Д-нейтрофилов в3-7 раз относительно нормы прогнозируют хроническую форму течениявоспалительного процесса,Способ осуществляют следующим50образом.У пациента берут кровь, разделение клеток крови производят наслаиванием цельной крови на двойной градиент , 1,070"1,073 Й 1,080-1,083 г/млс последующим центрифугированием при0 С и 1500 об/мин. Получают двечистые. популяции клеток: взвесь лимфоцитов между плазмой и раствором фиколл-уротраста с плотностью 1,070- 1,073 г/мл и взвесь нейтрофилов между двумя растворами с плотностью 1,070-1,073 и 1,080-1,083 г/мл.0,1 мл нейтрофилов310 клеток к 1 мп ) сливают с 0,05 мл раствора спонтанных эритроцитов барана и 0,05 мл 2,57-ного раствора комплементарных эритроцитов человека. Смесь клеток выдерживают 10-20 мин при 0-40 С. Затем центрифугируют 10-20 мин. при 0-4 С. Вторую инкубацию провоодят в течение 1-2 ч при 4-10 С, центрифигируют при 0-4 С и 1000-1500 об/ мин в течение 10-20 мин, фиксируют 32"ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере рН - 7,4 в течение 10-20 мин, Добавляют дистилированной воды и центрифугируют 5-15 мин при 1000-1500 об/мин. Насадок выбрасывают, оставляют 0,1-0,3 мл взвеси клеток, перемешивают и наносят на предметные стекла, Сушат, фиксируют метанолом в течение 5- 10 мин, красят азур-эозином 5-О мин. В препарате просчитывают 200 клеток. За роэеткообразующий Д-нейтрофил считают клетку, присоединившую три спонтанных эритроцита барана и три комплементарных эритроцита человека, Вычисляют процентное и абсолютное содержание розеткообразующих клеток,П р и м е р 1. Пациент А., здоровый донор.В силиконированную пробирку на 3 мл смеси фиколл-уротраста плотностью 1,073 г/мл и 3 мл смеси плотностью 1,083 г/мл наслаивают 3 мл крови с последующим центрифугированием при 4 С и 1500 об/мин в течение 20 мин. Получают две клеточные взвеси взвесь лимфоцитов и взвесь нейтрофилов, Взвесь нейтрофилов 310 в 0,1 мл соединяют с 0,05 мл 2,5 Е-ного раствора спонтанных эритроцитов барана и 0,05 мл 2,5 Е-ного раствора комплементарных эритроцитов .еловека. Смесь клеток выдерживают 20 мин при 4 С с последующим центрифугированием вотечение 15 мин при 4 С. Вторую инкубацию осуществляют в течение 90 мин. при 40 С. Фиксируют 20 мин 3 Е-ным раствором глютарового альдегида, центрифугируют, осадок наносят на предметные стекла, сушат, фиксируют метанолом 10 мин, красят азур-эозином в течение 10 мин, считают в 6-7 разных полях зрения в иммерсионной системе микроскопа 200 клеток, присоединяют10933 100 ф 00 3йе менее 3 ЭБ и 3 ЭЧ. Абсолютноесодержание Д-нейтрофилон рассчитываютпо формулеСгФ где Ь - количество нейтрофилов в1 мкл периферической крови;- нейтрофилы н формуле крови,.; О- Д-разеткообразующие неитро-филы,100 100-показатели, приводящие результаты к объему 1 мкл.В иммерсионной системе микроскопа н 7 разных полях 3. розеткообразуюших Д-нейтрофилов содержание лейкоцитов н 1 мкл крови 6750, процентное содержание нейтрофилов в формуле крови 60%. Подставив в формулу циф О ровые значения получим:6750360Д-РОН = ---- = 121 5 в 1 мкл3100 00(.норма)25 П р и м е р 2,Больнои Х., история болезни У 2382, поступил н клинику .по поводу фибропластической индурации полового члена. Сопутствующие заболевания - церебральный атеросклероз с явлениями эпилептоидных приступов сосудистого генеэа; остаточные явления полимиэлита.В силиконированную пробирку на 3 мл раствора фиколл-уротраста платт ностью 1,070 г/мл и 3 мл 1,090 г/мл 35 наслаинают 3 мл крови, центрифугируют в течение 10 мин при 0 С и 1000 об/мин, В результате оседают на дно эритроциты, взвесь лимфоцитов обоаэует кольцо над раствором фиколл уротраста с плотностью 1,070 г/мл, а взвесь нейтрофилов образует кольцо над раствором фикалл-уротраста с плот ностью 1,080 г/мл, Нейтрофилы в количестве 310 в 0,1 мл соединяют с 45 0,05 мо 2,5 -ного раствора спонтанных эритроцитов барана и 0,05 мл 2,5 -ного растнара комплементарных эритроцитон человека. Смесь клеток инкубировали 10 мин при ОС с после дующим центрифугированием в течение 1 О мин при 0 С и 1000 об/мин, Вторую инкубацию осуществляют н течение часа при 0 С. Фиксируют 15 мино3%-ным раствором глюторового альдеги 55 да с последующим центрифугиронанием при комнатной температуре в течение 5 мин. Осадок. наносят на предмет 25 4ное стекло, сушат, фиксируют 5 мин метанолом, красят азур-эоэином в течение 5 мин. Считают в иммерсионной системе микроскопа в 5-7 разных полях 200 нейтрофильных клеток, присоединивших не менее Э ЭБ и Э ЭЧ. В данном примере содержание Д-РОН н периферической крови 2425,5 н 1 мкл (35), Е-РОП(промиелоциты) 491,4 н 1 мкл (84 ), Е"РОМ (миелоцитм), 898,5 в мкл (96%) , Е-РОЮ( юных) 804,9 в 1 мкл (86 ) , Е-РОНп( палочкоядерных нейтрофилов) 1467,1 в 1 мкл (95 ) , Е-РОНс (сегментоядерных нейтрофилов) 2455,7 в 1 мкл (98%).В данном примере морфологические показатели клеточного состава костного мозга в пределах нормы,.: промиелоциты 5,0, миелоциты 8, палочкоядерные нейтрофилы 13,1, сегментоядерные нейтрофилы 21,4.Костно-мозговой индекс созревания нейтрофилов обозначает отношение молодых гранулоцитарных элементов к зрелым нейтрофилам. В норме он ранен 0,6-0,8. В данном примере он в норме и равен 0,6, Содержание клеток нейтрофильного ряда также в норме и составляет 55,6 . Однако сравнение суммы розеткообраэующих клеток нейтрафильного ряда в костном мозге и периферической крови показало следующее:Костный мозг (К 1)6115 6 в 1 мкл (воспаление)х ------ 1,05767,8 в 1 мкл (норма) Поздние тотальные Д-нейтрофилы 2425 д 5 в 1 мкл воспаление) 121,5 н 1 мкл (норма) 1У практически здорового человекаЕ-РОН (в костноммозге) 5788,5 в 1 мкл,Д-РОН (в периферической крови) 121,5 н 1 мкл,У бального человекаЕ-РОН (в костноммогзе) 615,6 н 1 мкл,Д-РОН (в периферической крови) 2425,5 в 1 мкл.Таким образом, при воспалении изменяется барьерная функция костного мозга и происходит ныход популяции нейтрофилов, участвующей в воспалительной реакции. Количество розеткообразующих поздних тотальных Д-нейтрофилов н периферической крови в норм. в 47 раэ меньше, чем розеткаобрачу 1093325щих предшественников нейтрофильногоряда в костном могэе. При активнойфазе воспаления содержание позднихД-РОН в периферической крови увеличивается в 19 раз. При купираваниипроцесса эти показатели нормализуютСя еП р и м е р 3. Больной Н история болезни 1 р 2056, поступил в клинику по поводу болезни Пейрони, Пока- Озатели крови; лейкоциты. 8400 в 1 мкл,сегментоядерные нейтрофилы 4032 в1 мкл (48 ) , палочкоядерные нейтроФилы 252 в 1 мкл (3%) , эозинофилы924 в 1 мкл (11 ) , лимфоциты 2268 5в 1 мкл (27 ) , маноциты 924 в 1 мкл(11 ) . В анализе мочи белок 0,093%рлейкоциты 20-30 в поле зрения, солиаксалаты и много слизи,3 мл периферической крови наслаива 20ли на 3 мл раствора фиколл-уротрастас плотностью 1,072 г/мл и 3 мл раст"вора с,плотностью 1,082 г/мл. Центрифугировали в течение 5 мин приО0 С и 1000 об/мин. В результате получали две клеточные взвеси: лимфоцитарную и нейтройнльную. Нейтрофилыв количестве Зе 10 в 0,1 мл соединяли с 0,05 мл 2.5 -ного раствора ЭБи 0,05 мл 2,5 .-ного раствора ЗЧ, Смеськлеток инкубировали 15 мин при 0 Сс последующим центрифугированием втечение 10 мин при 0 С и, 1000 об/мин.Вторую инкубацию осуществляли в течение 2 ч при 10 С, Фиксируют 20 мин353%-ным раствором глюторальдегида.Центрифугируют О мин при 1000 об/миносадок наносят на предметные стекла,сушат, фиксируют 7 мин метанолом,красят азур-эозином в течение 7 мин. 4 ОСчитают в иммерсианной системе микроскопа в 5-7 разных полях 200 Д-нейтрофилов.В данном примере содержание Д-РОН378,4 вмкл (13%), Е-РОП (прамиелацитов) 14,7 вмкл (78%)р Е-РОМ(37 ).В исследуемой периферической крови содержание лейкоцитов 4100 в1 мкл, сегментоядерных нейтрофилов2911 в 1 мкл (1%), палочкоядерныхнейтрофилов 41 в 1 мкл (1%), эозинафилов 41 в 1 мкл (1/)р лимфоцитов984 в 1 мкл (24%)р маноцитов 123 в1 мкл (3%), Таким образом, все показатели крой ви у больного в пределах нормы. В костном мозге сумма элементов нейтрофильного ряда также в норме и составляет 56,6 . Однако кастно-мозговой индекс созревания нейтрафилов зна. чительно ниже нормы и составляет 0,28, Сумма розеткообразующих клеток нейтрофильного ряда в костном мозге в 5 раз меньше, чем в норме: Костный мозг 196 3 в 1 Л.КМмкл дефицит)рмкл (норма)378 4 (дефицит)ю. Э121,5 (норма) 5767,8 в 1Д-РОН (ПК) У практически здоравага человека: Е-РОН - 5788,5 в 1 мкл (в костном мозге),Д-РОН - 121,5 в 1 мкл (в периферической крови). У больного с хроническим воспалительным процессом:Е-РОН - 1961,3 в 1 мкл (в костном мозге),Д-РОН - 38,4 в 1 мкл (в периферической крови),Таким образом, при хроническомвоспалительном процессе в костноммозге нарушается костна-мозгавай индекс созревания нейтрафилов и имеется глубокий дефицит розеткоабразующих нейтрофилов. Больной получалантибактериальную и витаминатерапию. После проведенной терапии состояние удовлетворительное, жалоб неттемпература утром и вечером нормальная. В анализе мочи лейкоциты 2-3 в поле зрения, В моче роста микрафлары не обнаружено.П р и м е р 4. Больная Р., история болезни У 645, поступила в больницу с диагнозом хронический пиелонефрит, правосторонний нефроптоз, Болеет в течение 5 лет При поступлении жалобы на тупые боли в поясничной области, субфибрильную температуру, сла бостье Аналич мочи; уд,вес 1025, реакция кислая, лейкоциты 6-8 в поле зрения, эритроциты 1-2 в поле зрения. В посеве мочи роста микрофлоры не, обнаружено.На рентгенограммах стоя и лежа снижение очистительной функции правой пачки с замедленным выведением препарата из нее, Дефицит суммарной очистительной способности почек 25 .5 аних Ц-РОН в 50 раз. Активация воспалительного процесса подтвержденаклиническими и лабораторными данными.Предложенный способ подвергалсятщательной проверке. Отработан метод количественного определенияпоздних (тотальных) Д-нейтрофилов всравнении с другими способами. Проведен сравнительный анализ у 16 клинически здоровых людей и 146 больных своспалительными заболеваниями почек.Таким образом, с помощью данногоспособа установили, что предлагаемыиспособ является прогностическим, таккак диагностирует наличие острогохронического воспалительного процееса, При остром воспалительном процессе количество поздних (тотальных)-нейтрофилов в периферической кровиувеличивается в 8-19 раэ, при вялотекущем хроническом процессе их коичество увеличено в 3-7 раз.Впервые разработан метод выявленияоздних (тотальных) Д-нейтрофилов.зучение популяции Д-нейтрофиловозволит изучить характер измененияанной популяции в организме человеа при ряде патологических состояний,которых участвуют нейтрофилы, вастности в гематологической практие, а также при воздействии на оргаиэм человека различных зкстремальх воздействий космические, океаологические исследования , а таке в различных областяхнародногоозяйства связанных с профессиональми вредностями,Впервые получены достоверные поаэатели поздних Д-нейтрофилов.Полученные данные меняют представ"ение не только о существующих норах, но и роли рецепторного аппараа Д-нейтрофилов в организме человека.Розеткообразующая способность поздних Д-нейтрофилов позволяет диагнос-тировать наличие или отсутствие деицита клеток - предшественников итем самым прогнозировать исход воспаительного процесса и необходимостькоррекции в лечении.Способ достаточно прост, атравматичен и может быть использован в любой клинике для прогнозирования теения воспалительного процесса, переода его в хроническую Форму, а свое"ременно и правильно подобр; иная тераия значительно сокращает срок лечения.Тираж 688 Поппи с-; кагород,.ул.Проектная,7 109332Заключение: у больной билотеральныйпиелонефрит с преимущественным поражением правой почки.3 мл периферической крови наслаивают на 3 мл раствора фиколл-уротраста с плотностью 1;071 г/мл и 3 млраствора фиколл-уротраста с плотностью 1,081 г/илцентрифугируют при1500 об/мин в течение 15 мин при 4 СПолучают две клеточные взвеси: лимфоцитарную и нейтроильную, Нейтрофилыв количестве 310 в 0,1 мл соединяютс 0,05 мл 2,5 -ного раствора ЭБ и0,05 мл 2,5 Е-ного раствора ЗЧ, Смеськлеток инкубируют 15 мин при 4 С с 15последующим центрифугированием в течение 15 мин при 1500 об/мин и 4 С.Вторую инкубацию осуществляют в,течение 1 ч,при 4 С. Фиксируют 15 мин До33-ным раствором глютеральдегида, 20центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин,осадок наносят на предметное стекло,сушатфиксируют метанолом 5 мин, кра"сят азур - зозином в течение 5 мин.Считают в иммерсионной системе микроскопа в 6-7 разных полях зрения 200 пД-нейтрофилов. д5,1 У,82,В периферической крови содержание лейкоцитов 7850 в 1 мкл,всегментоядерных нейтрофилов 3532,5в 1 мкл (45 ) , лимфоцитов 3454 в1 мкл (44 ), моноцитов 785 в 1 мкл(1), Д-РОН 812,4 в 1,мкл (23%).Больной назначена стимулирующая терапия продигиозаном. На фоне стимуля 35ции отмечена активация воспалительногопроцесса, Температура 39-40 С,оАнализ мочи по Нечипоренко: лейкоциты 12500 вмл мочи.кИммунологическое исследование 4 О16.1 У,82. Лейкоциты 16050 в 1 мкл,сегментоядерные нейтрофилы 14445 вм1 мкл (90 ),лимфоциты 1605 в 1 мкл(103),моноциты 160 в 1 мкл (1 ), Д-РОН 6789,2в 1 мкл (47%), Больной проведена интенсивная антибактериальная терапия.23,У,82, Лейкоциты крови 4300, фД"РОН 595,9 в 1 мкл (23%).Анализ мочи: уд.вес. 1015, лейка" л,циты 3-4 в поле зрения, эритроциты 0-1в поле зрения. Больная выписывается1под наблюдение уролога,Таким образом, содержание Д-РОНв периферической крови отражает ак- чтивность воспалительного процесса,хтак как стимулирующая терапия проди- в55гиазаном увеличивала содержание Позд- ииа///н В ///6//шйЧ,