Способ определения нейтрофилов, несущих f -рецепторы

,Чеботарь,бунова филами с поспедукипимток, несущих 1" -рецепнице в опытной и конпричем 1 дО предварита в качестве носителС 11 Вг-активированнуюкубацию проводят в т СССР 1983ОФИЛ озу, а ине 20-40 ми ечени ед ил,Кбоб отличаетсято в качестве н от известного тем ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Горьковский научно-исслеский педиатрический институтковский медицинский институтим. С.М,Кирова(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙТРНЕСУЩИХ Р -РЕЦЕПТОРЫ(57) Изобретение относится кне и может быть использовано Изобретение относится к медицине,а именно к иммунологии, и может бытьиспользовано для определения наличия1" -рецепторов на нейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета.Целью изобретения является повышение достоверности за счет стабилизации тест-системы,На фиг. 1 и 2 изображены графики,поясняющие предлагаемый способ,Поставленная цель достигается тем,что в известном способе определенияР -рецепции нейтрофилов человека,включающем инкубацию нейтрофилов с18 О-обработанным носителем используют СИВг - активированную сефарозу 4 В,1 дО агрегируют, а инкубацию нейтрофилов проводят в течение 20-40 минпри 36-37 С.Предлагаемый спос ЯО 152912 ределения наличия Г -рецепторов наснейтрофилах и оценки состояния противоинфекционного иммунитета, Целью изобретения является повышение достоверности способа за счет стабилизации тест-системы, Для достижения цели проводят обработку растворов 1 дО-носителя, инкубацию носителя с нейтроопределением клеторы, .по их раэтрольной пробах, ельно агрегируют, я используют сителя используют СИВг-активированную сефарозу 4 В, 1 О агрегируют, аинкубацию нейтрофилов проводят 2040 мин при 36-37 С,Использование СИВг-активированной .сефарозы 4 В в качестве носителя 1 Опозволяет стабилизировать тест-систему, так как активные грудпировки,СИВг способны к образованию ковалентной связи с белками, Использованиедругих носителей ( полистерен, миробные клетки) не обеспечивает оразования ковалентной связи с 1 О. Использование СОВг-активированной сефарозы 4 В в качестве носителя 1 аО исключает процесс поглощения, так какоазмеры гранул сефарозы (60-120 мкм)делают СИВг-активированную сефарозу 4 Внедоступной поглощению нейтрофилами,1 яО агрегируют, так как посредством агрегации достигается изменениеконформационной структуры иммуногло 1529120булина с переходом его Рс -фрагментав положежле наиболее оптимальное длявзаимодействия с Р,-рецепторами клеток, что приводит к повышени стабиль5ности тест-системы,Лнкубацию нейтрофилов проводят 2040 мин, так как за это время адгезиянейтрофилов на гранулы 1 РС-связаннойсефароэы 4 В достигает максимума, затем начинает снижаться, На фиг. 1 показан выбор оптимального времени инкубации при взаимодействии нейтрофилов человека и 1 дС-связанной сефарозы 4 В; по оси абцисс - время инкубации, по оси ординат - процент адгезированных нейтрофилов. Предлагаемыевременные параметры являются оптимальными для стабилизации тест-системы( фиг. 1),ОВыбор температурных параметров (3637 С) обусловлен созданием наиболеефизиологичных ( температура человеческого тела) условий для функционирования нейтрофила и обусловлен экспериментально,На фиг. 2 показан процесс адгезиипри различных температурных режимах(выше +37 С нейтрофил разрушается) ииллюстрирует максимальную адгезиюпри 36-37 С.Предлагаемый способ определения Р -срецепции нейтрофилов человека имеетследующие преимущества перед известными: в предлагаемой тест-системе носитель ковалентно связан с агрегированным 1 С что делает систему стабильной ( срок годности 12 месяцев и более);стабильность обеспечивает хорошую воспроизводимость определения нейтрофилов,40несущих Г -рецепторы и дает возможность изучать Р -рецепцию в динамике;Iданная тест-система позволяет целенаправленно выявить нейтрофилы, несущиеР -рецепторы, так как адгеэия нейтрос45филов в предлагаемом способе инициируется Р -рецепторами; предлагаемаястест-система дает возможность получитьобъективные данные, так как по предлагаемому способу исключается процесспоглощения нейтрофилами носителя 1 С,П р и м е р. Лммуноглобулин 1 дС по-,лучают из коммерческого иммуноглобулина методом хроматографии на диэтиламиноэтилтояполеМ ("ТоуоБойа" Япония) по методике Брок И,1 дС агрегируют прогреванием прио63 С в течение ЗЭ мин. Агрегированный1 С ковалентно связывают с СИВг-активированной сефарозой 4 В ("Рйагтпаса" 1 веция), Для этого лиофилиэированную сефарозу 4 В, активированнуюСИВг регидратируют в 0,001 М растворе НС 1 и промывают двумя литрамиэтого же раствора на пористом стеклянном фильтре, Затем на этом же.фильтре СИВг - активйрованную сефарозу4 В отмывают 200 мп связывающего буфера (0,1 М раствор МаСОэсодержащий О, 5 М ИаС 1 рЧ 8, 3), К промытомуосадку сефарозы добавляют раствор агрегированного 1 С (10 мг/мл) из расчета 10 мг на 1 мл геля, инкубируют2 ч при комнатной температуре или 16 чпри 4 СПереносят гель в буфер сагентом, блокирующим свободнь 1 е активные группы СИВг (0,2 М раствор глицина, рН 8,0) и инкубируют 2 ч прикомнатной температуре или 16 ч при4 С. Удаляют недостаточную жидкостьи отмывают осадок 200 мп 0,1 М раствора СНСООМа содержащим 0,5 М МаС 1,Затем отмывают 200 мл связывающегобуфера (0,1 М раствор ИаСОсодержащий 0,5 М ИаС 1 рН 8,3) и дваждыотмывают (по 50 мл) раствором Хенкса,Сефароза 4 В, ковалентно связанная сагрегированным 1 дС готова к употреболению, Хранят при 4 С, Нейтрофилы выделяют из крови здоровых людей в двойном градиенте плотности фиколл-верографин (1116 и 1,077 г/см ), взвешиЭвают в растворе Хенкса в концентрации 5 млн,клеток/мл . Смешивают в равных объемах ( по 0,2 мл) нейтрофилы(концентрации 5 млн,клеток/мп) ивзвесь 1 дС-связанной сефарозы (концентрация 20000 гранул/мп), инкубируют 20-40 мин при 36-37 С. Контролем служит реакция с сефароэой, несвязанной с 1 дС, После инкубации сефарозы с нейтрофилами в каждую про 4бирку заливают по 1 мп раствора Хенкса, Через 3 мин, когда гранулы сефарозы осядут на дно пробирки, подсчитывают число клеток в супернатанте спомощью камеры Горяева, Подсчет клеток для опытной (с 1 цС-связанной сефарозой) и контрольной (с сефарозой, несвязанной с 1 дС) проб ведется по всей камере Горяева (в 225 квадратах), Показатель Гс -рецепции нейтрофилов(Р -ПРН)спроцент нейтрофилов, содержащихрецепторы к Рс-фрагменту выражается по следующей формуле,опыт1 -ПРНОО-( ---- ОО),сконтроль20 6методике фирмы-изготовителя ("Рйаглас 1 а" Швеция) .Взвесь нейтрофилов с 1 О-связаннойсефарозой инкубировали в равных объемах (по 0,2 мл) 30 мин при 37 С (концентрация нейтрофилов 5 млн/мл; концейтрация сефарозы 20000 гранул/мл),В контроле использовали сефарозу, несвязанную с 1 яО, После инкубации вкаждую пробирку добавляли по 1 мл раствора Хенкса. Затем в камере Горяеваподсчитывали количество клеток из надосадка в опыте и в контроле опыт90 -иейтрофилов; контроль - 150 нейтрофило в,Способ определения нейтрофилов, несущих Рс -рецепторы, включающий обработку растворов 1 яЫ-носителя, инкубацию носителя с нейтрофилами с последу;ощим определением клеток, несущих Г -рецепторы, по их разнице в опытной и контрольной проРах, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьпдения достоверности способа за счет стабилизации тест-системы, 1 О предварительно агрегируют, в качестве носителя используют С 1 Пг-активированную сефарозу, а инкубацию проводят в течение 20-40 мин,5 15291где опыт - количество нейтрофилов, поц-,считанных в 225 квадратах камеры Горяе"ва, в опытной пробе; контроль - количество нейтрофилов, подсчитанных в .225 квадратах камеры Горяева, в контрольной пробе,В опыте нейтрофилы активнее присоединяются к 1 дО-связанной сефарозе,поэтому в надосадке их содержитсяменьще по сравнению с контролем. Разделив количество нейтрофилов из надосадка в опыте на количество нейтрофи-,лов из надосадка в контроле и умноживна 100, получают процент клеток, оставт 5иихся в надосадке, Следовательно, оставшиеся клетки (от 100% вычесть процент клеток в надосадке) присоединились к 1 дО-связанной сефарозе - этои есть процент клеток, содержащих рецептуры к Р -фрагменту иммуноглобулиснов 1 цО,Проведена оценка Р -рецепторов нейСтрофилов у исследуемого донора Мастеровенко С.А 22 лет. 25 .В стерильных условиях из вены получено 3,0 мл крови, Нейтрофилы выделяли путем центрифугирования в двухступенчатом градиенте плотности (1,116и 1,077 г/см ) фиколл-верографин, ПооЛе двухкратного отмывания физиологическим раствором (общий объем 20 мл)нейтрофилы ресуспендировали в растворе Хенкса, Конечная концентрация нейтрофилов - 5 млн,клеток/мл, Все манипуляции прбводили в силиконированИой посуде,СБВг-активированную сефарозу 4 Веязывали с агрегированным 1 яО по Р -ПРН=100-00) =100-60=40%.9050У исследуемого донора показательГ-рецепции нейтрофилов равен 40%, т,е,40% нейтрофилов содержат рецепторы кГ -фрагменту 1 дО,Формула изобретения+ РГ 7 емжраеура ФОГ Я Составитель А,МакаровТехред М.Дидык Корректор Н,Король Редактор Т,Парфелова Заказ 7634/39 Тираа 789 Подпи с ноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101