Способ разделения лимфоцитов периферической крови

Союз СоветскихСоциапистичеснихРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51) М. Кл. А 61 К 35/14 Гоеударствснный комитет по делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Цель дост гаемый спосо периферицеск тем проведен зования лимф последующим лученных роз ти фиколл-ве нием реакции из компонент трафиолетовы ны 250-260 н в течение 1 При этом о фоциты и эриСпособ осу те плотнос д проведевания один учают уль"длине во ,8.10 эрг ток в градие ографин, пер розеткообраз в реакции об и лучами при/см в дозе ,5 мин. блучени роциты. двергают ли 15 вляют следующим обом.Кровь рут методом пункции локтенора, Дефибринирование еенемедленно после взятия,ия деревянной палочкой илия со стеклянными бусами вмин. Для приготовлениялотности 9,67 граммов фивои ве роизводя еремешив встряхива течение 1 радиента и инградский ордена Трудового К чно-исследовательский институи переливания крови Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается разделения лимфоцитов периферической крови, используемых для имуннизации с целью получения диагностических специфических анти-Т и анти-В сывороток, а также для изучения роли тканевых антигенов покуса Ш.А - Рк в иммунном ответе.Известен способ разделения лимфоцитов периферической крови путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности Фиколл-верографин.Недостатком известного способа является то, что используют дорогостоящий, дефицитный фермент, а также длительность постановки реакции по этой методике.Целью изобретения является упрощение способа,гается тем, что предларазделения лимфоцитов й крови осуществляют пуя реакции розеткообрацитов с эритроцитами с ентрифугированием по25 3 89543 колла растворяют в 122,5 мл дистиллированной воды и смешивают с 20 мл 763-ного верографина. Удельный вес полученной смеси равен 1,077- 1,079 г/мл. Дефибринированную кровь смешивают с равным объемом раствора Хенкса, тщательно перемешивают встряхиванием и осторожно по стенке про" бирки наслаивают на градиент плотности Фиколл-верографин в соотношении о 2: 1, Центрифугируют в реФрижераторной центрифуге при 600 р и + 4 оС в течение 30 мин, Клетки, скопившиеся на границе раздела двух фаз и визуально определяемые в виде опалесцирую щего кольца, осторожно отсасывают с помощью пастеровской пипетки или шприца с длинной иглой. Клеточная взвесь представляет собой преимущест. венно мононуклеары, содержание лимфоцитов в ней при микроскопическом контроле должно быть не менее 953. Полученную суспензию лимфоцитов отмывают дважды, добавляя смесь инактивированной сыворотки группы АВ (1 Ч) и раствора Хенкса (1: 10) и центрифугируя при 600 д в течение 5 мин. Суспендируют лимфоциты в смеси равных объемов инактивированной сыворотки крови группы АВ (1 Ч)ЗО и раствора Хенкса (без Фенолового красного) в концентрации 45 10кл/млДля получения лимфоцитов суспензию лимфоидных клеток в указанной концентрации наливают в бюксы кварцевого стекла так, чтобы толщина слоя жидкости была в пределах 8- 12 мм. В бюкс опускают .тонкий металлический стержень, длина которого соответствует диаметру бюкса и помещают его на магнитную мешалку, Скорость вращения стержня должна быть около 30-40 об/мин. Облучение проводят с помощью бактерицидной лампы ДБп, основная часть излучения которой имеет длину волны 254 Щс.Доза облучения 1,3-1,810 эрг/мм", 45 Облучение проводят в тецение 1-1,5 мин. Расстояние между трубкой и облуцаемой поверхностью 15-20 см.Эритроциты барана получают методом пункции яремной вены животного, де фибринируют перемешиванием деревянными палочками и течение 10 мин и сохраняют в растворе Элсвера (глюкоза 2,5 гр, лимоннокислый натрий 0,8 г и поваренная соль 0,42 г на у 100 мл дистиллированной воды). Предельный срок хранения эритроцитов 3 недели. Перед постановкой реакции 9розеткообразования эритроциты баранатрижды отмывают раствором Хенкса исуспендируют в концентрации 455 10 кл/мл в смеси равных объемовинактивированной и дважды сорбированной эритроцитами барана сывороткикрови группы. РВ (11/) и раствора Хенкса. Взвесь облученных лимфоцитов вконцентрации 4,5-5 10 смешивают с6равным объемом взвеси бараньих эритроцитов (концентрации 4,5-5 10)тщательно перемешивают и инкубируютов течение 30 мин при 37 С. Затем центрифугируют при 400 д в течение 10 мини помещают на 1 ц в холодильник(+4 С),Указанную смесь наслаивают наградиент плотности фиколл-верограФин (состав смотри выше) в соотношении 2:1 и центрифугируют при 600 цв течение 30 мин, На границе двухфаз появляется опалесцирующее кольцо,представляющее собой взвесь В-лимфоцитав, которые собирают пастеровскойпипеткой или шприцем с длинной иглой,дважды отмывают смесью раствораХенкса и инактивированной сывороткикрови группы АВ (1 Ъ) в соотношении10". 1 и суспендируют в этой же смесив концентрации, необходимой для дальнейшей работы. Осадок представляетсобой Т-лимфоциты, нагруженные бараньими эритроцитами, Для того цтобылизировать бараньи эритроциты, осадокзаливают 10 мл смеси, содержащейХа 2 ЭДТА - 0,023 (1 цасть) и Н 4 С 10,833 (9 частей), приготовленныхех 1 ещроге, выдерживают 10 мин при18 С и центрифугируют при 600 ц в течение 10 мин. Полученную взвесь Т-лимФоцитов дважды отмывают растворомХенкса и доводят до нужной концентрации.П р и и е р 1, Из периферическойкрови донора тест-клеток выделяютлимфоциты. Для этого к 16 мл дефибринированной крови добавляют 16 млраствора Хенкса, тщательно перемешивают и наслаивают на Фиколл-верограФин в отношении 2: 1. Отцентрифугируют при 4 С 30 мин при 1450 об/мин нареФрижераторной центриФуге К,Слойклеток, скопившийся на границе раздела 2-х фаз, осторожно собирают пастеровской пипеткой и дважды отмываютинактивированной сывороткой АВ (1 Чгруппы), разведенной раствором Хенкса в 10 раз, Клетки суспендируют вконцентрации 5 10 Ь кл/мл в смеси рав5 89543ных объемов инактивированной сыворотки группы АВ (11) и раствора Хенкса.Взвесь лимфоцитов в 50/-ной сыворотке крови группы АВ (1 Ч) помещаютв стеклянные бюксы, толщина слоявзвеси 10 мм (около 1 мл) и облуцаютультрафиолетом с длиной волны 254 нмв дозе 1,3 -10 эрг/мм в течение 1 мин,3Расстояние между трубкой и,облучаемой поверхностью 15 см. Облучение про фводят при постоянном перемешиваниисуспензии с помощью магнитной мешалки,Из эритроцитов барана, трижды отмытых раствором Хенкса, готовят 15взвесь с концентрацией 5 10 кл/мп винактивированной и дважды сорбированной эритроцитами барана сыворотке крови АВ (1 Ч), разведенной равным объемом раствора Хенкса. 5 мл суспензии уоблученных лимфоцитов смешивают сравным объемом взвеси бараньих эритроцитов в указанных концентрациях,тщательно перемешивают и инкубируют30 мин при 37 С, затем центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин и выдержиовают в холодильнике при +4 С в течение 1 ч. Указанную смесь наслаивают на фиколл-верографин в отношении2: 1, центрифугируют при 1450 об/мин зпв течение 30 мин,Образовавшийся на границе двухфаз слой клеток, содержащий В-лимфоциты, осторожно собирают пастеровской пипеткой и дважды отмывают смесью раствора Хенкса и 104-ной инактивированной сыворотки крови группыАВ (1 Ч) в соотношении 10:1. Осадок,представляющий собой Т-лимфоциты,нагруженные эритроцитами барана,обрабатывают смесь ИаЗДТА 0,024(1 часть) и %1 С 1 0,831 (9 частей),приготовленных ехйещроге для лизисабараньих эритроцитов в течение 10 минЗатем полученную взвесь Т-лимфоцитовдважды отмывают раствором Хенкса. Образовавшееся на границе двух фаз кольцо, содержащее В-лимфоциты, осторожно снимают. Взвесь клеток дважды отмывают раствором Хенкса с добавлением в него 10"г,-ной инактивированной сыворотки крови группы АВ (1 Ц и доводят до нужной концентрации. Результаты тестов, поставленныхпо ходу опыта следующие.Розеткообразование определяют почислу активных Т-розеток.Необлученных лимфоцитов с эритроцитами барана 46,2,Облученных лимфоцитов с эритроцитами барана 773Жизнеспособность лимфоцитов в полученных субпопуляциях (по трипаново"му синему). Т-лимфоциты 981 В-лимфочиты 97,9 6Чистота полученных субпопуляций(методом подсчета розеток с Т-лимфоцитами (Т-РОК), Т-лимфоциты 984,В-лимфоциты 971.,П р и м е р 2. Из периферическойкрови донора тест-клеток выделяютлимфоциты, Для этого к 16 мл дефибринированной крови прибавляют 16 млраствора Хенкса, тщательно перемешивают и наслаивают на фиколл-верографинв отношении 2:1. Центрифугируют при1450 об/мин, +4 С в течение 30 минна рефрижераторной центрифуге К". 70.Снимают образовавшееся на разделедвух фаз кольцо лимфоцитов шприцемс длинной иглой и дважды отмываютих инактивированной сывороткой кровигруппы АВ (1 Ч), разведенной растворомХенкса в 1 О раз. Концентрацию клетокдоводят до 5 10 в 1 мл с помощьюинактивированной сыворотки кровигруппы АВ (1 Ч), наполовину разведен"ной раствором Хенкса,Взвесь лимфоцитов в 50-ной сыворотке крови группы АВ (1 Ц помещаютв стеклянные бюксы, толщина слоя 12 мми облучают ультрафиолетом с длиноволны 254 в дозе 1,8 10 эрг/ммв течение 1,5 мин. Расстояние междутрубкой и облучаемой поверхностью20 см, Облучение проводят при постоянном перемешивании суспензии с помощью магнитной мешалки,Из трижды отмытых эритроцитовбарана готовят взвесь с концентрацией 4,5.10 кл/мл в инактивированнойи дважды сорбированной эритроцитамибарана сыворотке крови группы АВ(1 Ч), пополам разведенной растворомХенкса.Смешивают равные объемы облученныхлимфоцитов и бараньих эритроцитовв указанных концентрациях, тщательноперемешивают и инкубируют 30 мин при37 С, затем центрифугируют 10 минпри 1000 об/мин и выдерживают в холлодильнике при +4"С в течение 1 ч.Указанную смесь наслаивают на фиколлверографин в соотношении 2:1, центрифугируют при 1450 об/мин в тецение30 мин.895439 Формула изобретения Составитель С.Малютина Редактор О.Юркова Техред А, Савка Корректор 1. РоакоФ Заказ 11533/8 Тираж 716 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 1 13035, Москва, Ж, Раушскгя наб д,4/5Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 Осадок, представляющий собой Т-лимфоциты, нагруженные эритроцитами барана, обрабатывают смесью МаЭДТА 0,021 (1 часть) и ИН Г 1 0,831 (9 цастей), приготовленных сх 1 етроге для лизиса бараньих эритроцитов, в течение 0 мин. Затем полученную смесь Т-лимфоцитов цважды отмывают раствором Хенкса и доводят до нужной концентрации, оРезультаты тестов, полученных по ходу опыта следующие.Розеткообразование определяют по числу активных Т-розеток.Необлученных лимфоцитов с эригро цитами барана 37,71Облуценных лимфоцитов с эритроцит тами барана 58,4 ь.Жизнеспособность лимфоцитов в полученных субпопуляциях (по трипа новому синему) Т-лимфоциты 981, В-лимфоциты 96.Чистота полученных субпопуляций (методом подсчета Т-РОК) Т-лимфоциты 97, В-лимфоциты 97. 25Предложенный способ позволяет разделить лимфоциты периферической крови и получить субпопуляции клеток высокой степени чистоты, способ не требует дефицитного импортного фермента, при этом обработка известным способом занимает 1,5 ч, а облучение предложенным способом 2 мин. 1. Способ разделения лимфоцитов периферической крови путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности фиколл-верографин, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, перед проведением реакции розеткообразования один из компонентов реакции облучают ультрафиолетовыми лучами при длине волны 250-260 нм в дозе 1 3 Эу 1,8 10 эрг/см в течение 1-1,5 мин,2. Способ по п.1, о т л и ц а ю - щ и й с я тем, что облучению подвергают лимфоциты.3, Способ по пп.1-2, о т л и ч а ю щ и й с я тем что облучению подвергают эритроциты.