Способ выделения лактопероксидазы

7 В АДРОН г.7 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ.ИЗОБРЕТЕНИЙИ ОТКРЫТ ОПИСАНИЕ И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(71) Ленинградский ордена ТрудовогоКрасного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии имикробиологии им.Пастера(54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛАКТОПЕРОКСИДАЗЫ из молока .коров, включающийсорбцию сырья на карбокснметилсефадексе с элвцией 0,02 И маг-,НС 1 буфером, содержащим 0,2 11 ИаС 1, прирН 7,4, высаливание Фермента сульфатом аммония при 60-70-ной степенинасыщения и изоэлектрофокусирование,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения выхода целевогопродукта и ускорения процесса, измолока предварительно осаждают каэеин при рН 4,0-4,5 с отделением осадка центрифугированием, элюат с карбоксиметилсефадекса концентрируютмикрофильтрацией в 10-15 раэ посравнению с исходным объемом на мембране из сополимера метилметакрилатаи винилпирролидона с диаметром пор200 + 20 А, а иэоэлектрофокусированиепроводят в линейном градиенте рН 7,410,0, который создают борат-полиальными буферными растворами.Изобретение относится к биохимической промышленности, а именно к получению особо чистых биохимическихпрепаратов и может бить использова но в научно-исследовательской работе.Лактопероксидаэа применяется дляиоднрования белкови липидов, припоставке радиоиммунологическогометода исследования (РИМ), иммуноФерментного метода, Ее бактерицидныесвойства могут бить использованы 10для стерилизации молочных продуктов.Известны способы выделения и очистки лактопероксидазы (ЛПО) из слюнычеловека н молока крупного рогатогоскота с помощью комбинации методов: 35ионнообменной хроматографии, гельхроматограФии на сефадексах, висйли-,вания сульфатом аммония, иэоэлектроФокусирования на амфолитах 1Наиболее близким по технической ;рсущности является способ выделениялактопероксидазы нз молока коровпутем сорбцин сырья на карбоксиметилсефадексе, элюции 0,02 И ж)ис-НС 1 буфером, рН 7,4, содержащим 0,2 И 25ИаС 1, высаливания фермента иэ элюата сульфатом аммония при степени на-сыщения бОн изоэлектрофокусирования на амфолитах 2,Однако на этапе сорбции лактопе- З 0роксидазы (ЛПО) на И-сефадексе казеин выпадает в осадок. Твердыечастицы казеина способствуют агрегацнн сефадекса, чтд препятствуетприсоединению лактопероксидазы, затрудняет ее последующую элюцию иисключает возможность многократногоиспользования КИ-сефадекса.Низкая концентрация белка в элва те (материал после ноннообменнойхроматограФии) приводит к его потерям при дробном высалнвании сульфатомаммония, так как при добавлении солиОбразуется тонкая взвесь белка, которую трудно полностью извлечь нзраствора. 45Изоэлектрофокусирование на амфолитах - длительный процесс, так как естественный градиент рН ( на основе полиаминополикарбоновых кислот) образуется в результате 20-часового предварительного электрофореэа, а весь процесс разделения белков на амфолитах занимает около 60 ч. В результате выход целевого продукта недостаточно висок, а продолжительность способа длительна.Цель изобретения - повьваение выхода целевого продукта и ускорение способа его выделения.Укаэанная цель достигается тем, 60 что согласно способу выделения,лактопероксидаэы нз молока коров, включающему сорбцию сырья на карбоксиметнлсефадексе с элюцией 0,02 ИмрмС-НС 1 буфером, при рН 7,4, содер жащим 0,2 И ИаС 1, висаливание фермента сульфатом .аьмония при 60-70-ной степени насыщения и иэозлектрофокусированне, предварительно осаждают казеин из молока при рН 4,0-4,5 с отделением осадка центрифугированием, концентрируют элюат микрофильтрацией в 10-15 раэ по сравнению с исходным объемом на мембране из сополимера метилметакрилата и винилпирро. лидона с диаметром пор 200 + 20 Л, и проводят изоэлектрофокусирование в линейном градиенте рН 7,4-10,0, который создают борат-полиольными буферными растворами.Удаление казеина из молока перед сорбцией ЛПО на КИ-сефадексе способствует, увеличению емкости ионообменника по целевому продукту ( казеин в данном случае является балластным белком), что приводит к повышению выхода ЛПО и ускорению процесса сорбции и дальнейшему выделению.Концентрирование элюата ( раствора белка, десорбированного с КИ-сефадекса) позволяет сократить потери белка при последуквцеи высаливании сульфатом аммония, благодаря образованию более плотного осадка н, следовательно, более полному отделению его, и сократить длительность процесса. Введение этого этапа в способе выделения и очистки ЛПО также приводит к повышению выхода целевого продукта.Проведение изоэлектрофокусирова ння не в естественном градиенте рН ( устанавливается в процессе электрофореза амфолитов), а в искусственном градиенте рН (устанавливается путем искусственного последовательного наслоения борат-полнольных буферных растворов с различными значениями рН) в диапазоне рН 7,4-10,0 ускоряет и удешевляет способ. Это позволяет также избежать основных потерь активности при сокращении длительности процесса. Проведение одного опыта предлагаемым способом в 100-120 раэ дешевле по сравнению с известным способом. Создание искусственного линейного градиента рН занимает около 30 мин, а процесс разделения белков в этом градиенте рН длится 20- 24 ч. Термином "искусственный градиент рН" пользуются в методе изоэлектрофокусирования в борат-полиольных буферных системах для того, чтобы подчеркнуть его принципиальное отличие от электрофокусирования в амфолитах 3 ).П р и м е р 1 . Для выделения ЛПО берут б л коровьего молока, которое хранят при температуре -20 С, Молоко предварительно обезжирнвают центрифугированием при 300 об/мин втечение 30 мин на центрифуге Я - 70( 2600 д) .Казеин осаждают при рН 4,0-4,5установленном с помощью 0,5 М раствора НС 1, РН в растворах определяютс помощью РН-метра ЛПУ - 01. Осадокказеина отделяют центрифугированиемпри 300 об/мин в течение 20 мин нацеитрифуге Я. Затеи к молочнойсыворотке добавляют сухой необработанный КИ-сефадекс Сиз расчета2 г на 1 л сыворотки. Сорбцию ЛПОна ионообменном сефадексе ведут втечение 5 ч при комнатной температуРе при постоянном перемешивании.Сефадекс отделяют на воронке Бюхнера и просеивают 2 л воды, а к Фильтрату добавляют новую порцию сефадекса и рроводят повторную сорбциюЛПО,ЛПО элюируют на воронке Бюхнера0,02 ИЩмю-НС 1 буфером, содержащим0,2 И ЯаС 1 (рН буфера соответствуетРН молочной сыворотки, отделеннойот сефадекса). Буфер порциями по50 мл осторожно наслаивают на сефадекс и через 10-15 мин отсасываютпод вакуумом при давлении 0,02 атм.Элюацию заканчивают, когда оптическаяплотность элюата при длине волны412. нм становится равной нулю. Сефадекс после окончания элюации регене-рируют, обрабатывая его йоследовательно 0,5 М ИаОН и 0,5 И НС 1, и используют в дальнейших опытах.Элюат ( 1 л) концентрируют микроФильтрацией на мембране "Рипор" 35до 100 мл с помощью прибора ФМподдавлением 4 атм.. Концентрированный элщат подвергают дробному высаливанию сульфатом аммония. Осадок белка (558 мг, 40полученный в пределах насыщенияэлюата сульфатом аммония 60-80 (грубая ЛПО), диализуют в течение сутокпротив проточной воды и в течениесуток против буфера 0,3 М борнаякйслота 0,33 Маари-; РН 8,3 и используют для изоэлектрофокусированияв искусственном РН-градиенте,Искусственный градиент РН 7,410,0 создают следующим образом. 50Буферные растворы с РН 7,4-8,3 готовят, добавляя к основному буферному раствору 0,3 М ббрная кислота 933 М 7 ярас , РН 8,3 глицерин, дотитровывая РаствоР до требуемой величины РН. Буферные растворы сРН 8,3-10,0 готовят путем подщелачивания основного буФерного растворааммиаком,Буферные растворы с рн 7,4; 7,бу7,8) 8,1; 8,3 у 8,5 у 8,7 у 9,0 р 9,2 у 609,4; 9,6; 10,0 объемом по 2,5 млпоследовательно: наслаивают с помо".щью перистальтического насоса в аналитическую колонку для изоэлектрофокусирования, 65ГрубуюЛПО наносят в объеме 0,5 мл( 2,0 мг белка, удельная активность0,350) после буферного раствора срЙ 7,8, соответствующего растворупо плотности, которую определяют нарефрактометре РПЛ-З,В качестве электродного буфера используют основной буферный раствор:0,3 И борная кислота - 0,33 МРврис-,РН 8,3.Нзоэлектричское Фокусированиепроводят в аналитической колонкеобъемом 50,0 мл в течение 16 ч. Напряжение на электродах 750 В (градиент напряжения 15 В/см) создают спомощью источника постоянного тока.После окончания электрофореза содержание колонки отбирают сверху фракциями объемом по 3 мл. Фракции дна"лизуют против 0,85-ного раствораИаС 1, определяют в них концентрациюбелка и Ферментативную активность,рассчитывают удельную активностьфермента и строят злектрофореграммы.Степень очистки препарата послеизоэлектрофокусирования определяютметодом злектрофореза в 7,5 Ъ-номполиакриламидном геле в кислой среде, РН 3,2,Результаты опыта представленына фиг, 1, Белок проявляет наибольшую пероксидазную активность в двухзонах: с рН 8,1 н рН 9,9. Белок сизоэлектрической точкой 9,9 образует при электрофоретическом разделе"нии в полиакриламидном геле однусдвоенную полосу ( Фиг. 2). В коммерческом препарате ЛПО, выпускаемойфирмой "Я 1 упа", наблюдаются дведополнительные диффузные белковыезоны, обнаруживаемые в препаратегрубой ЛПО и отделяемые при изоэлектрофокусировании в. искусственном линейном градиенте рН 7,4-10,0.Общее количество препарата, получаемое в одном опыте, составляет11,9 мг. (материал с 25 аналитических колонок для изоэлектрофокусирования),4П р и м е р 2 . Выделение вочистку проводят аналогично примеру 1. Отличия заключаются в концентрировании элюата микрофильтрациейв 15 раз, что не приводит к сущест"веннаму увеличению количества белкаосаждаемого на последующем этапе выделения, и в изменении нагрузки на колонку. Для очистки нзоэлектрофокусированием в одну аналитическую колонку вносят 4,0 мг белка.Результаты опыта представленына фиг, 3. Максимальную удельнуюактивность проявляют белки с изоэлектрическими точками 8,0 и 9,9,что является свидетельстжж хорошейвоспроизводимости получаемых резуль"татов, приведенных в примере 1. Небольшой пик с изоэлектрической точ1024501 Показатели Препарат предлагаемом известном 22 200 0,98 9,З 1,9 1,9 0,2 Выход ЛПО Степень чистоты (см. Фиг. Ц Одна сдвоеннаяполоса (злектрофорез в ПААГ ) кой 8,05 образуется, возможно, прибольшей нагрузке на колонку за счетминорного компонента грубой ЛПО.С одной аналитической колонки вданном опыте получают 400 мкг белка,Сорбция на КИ-сефа- Элюат с КМдексе. сефадексаПробное высалива- Грубая ЛПОние сульфатомаммония Изоэлектрофокуси- Очищенная ЛПОрование1 Таким образом, предлагаемый способ выделения и очистки ЛПО позволяет повысить выход ЛПО приблизительно в 10 раэ по сравнению с известным см.,таблицу), благодаря более полной сорбции ЛПО на КИ-сефадексе и последующей ее элюации, а также в результате сокращеНия потерь белка на этапе дробного высаливания сульфатом аммония; ускорить процесс выделения и очистки ЛПО в два раза Показатели общего количества белка, получаемого из 1 л коровьего молока на различных стадиях выделения и очистки лактопероксидазы (ЛПО) приведены в таблице. Общее количество белка, мг в способе Одна сдвоенная полоса и 2 диффузныезоны (электрофорезв ПААГУ эа счет иэоэлектрофокусирования в35 искусственном рН-градиенте; понизитьстоимость выделения и очистки ЛПО,благодаря многократному использованию КМ-сефадекса и применению дешевых отечественных реактивов для40 создания рН-градиента. Экспериментпо изоэлектрофокусированию наамфолитах стоит 28 руб, а вискусственном рН-градиенте40 ком,1024501 6 рн 0 О РО оставитель О. Скехред А,Бабинец актор Н. Гунь каз 4336/24 го комит ений и о ушская на 1130 илиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная," Тираж 523НИИПИ Государственпо делам иэобр5, Москва, Ж, Р думоваКорректор О Билак