Способ определения активности протеиназ

Оаз СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК НВЯОп) 156 1) С 01 И 33/4 2 Я 1/3 ТЕН ЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ юл. Р 18ий на учнот рыбногоИнститут тносится к ЬиохимиПрепараты Ферения протеолиолития / од ред, 981, с. 43 тоянсубстра желатин щих от не ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЭ(71) Атлантическтельский институи океанографии иим. А.Н.Баха(56) ГОСТ 20264.2-74ментные. Метод опредетической активности.Методы исследованической системы кровиГ.В.Андреенко, М,:МГУ45. Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способам определения активности протеиназ, и может быть использовано при практических работах в энзимологической, пищевой и рыбообрабатывающей промышленности, и особенно дпя быстрого определения пригодности сырья для производства Ферментных препаратов,Цель изобретения -повышение точности и упрощение процесса.Способ заключается в том, что ферментный раствор наносят на куски Фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины. Этот прием исключает необходимостьиспользования точной мерной посуды и обеспечивает оперативность выполнения определения. В качестве субстрата используют жела(54) СПОСОБ ОПРЕДПРОТЕИНАЗ(57) Изобретениеческому анализу тических работ в батывающей отрасл Цель изобретения ти и упрощение пр активности протеи ется во взаимодей раствора с желати регистрации степерата по скорости на. Реакцию право вания пропитанныхром кусков фильтрФотопластину. 2 т при проведении пракпищевой и рыбообраях промышленности.- повышение точносоцесса определенияназ. Способ заключаствии Ферментногоном Фотопластины ини гидролиза субстрастворения желатидят путем накладыФерментным раствоовальной бумаги наабл,тин, нанесеннын ровным слоем, посной высоты на Фотографические пластины. Замена быстропортящегосята на стандартнь 1 е пластины с овым слоем избавляет работаюобходимости частого приготовленияреактива. далее реакцию ферментногораствора с субстратом осуществляютпутем накладывания смоченной раствором Фермента Фильтровальной бумагина покрытую слоем желатина сторонуФотографической пластины и выдерживаиия пластины в течение определенного интервала времени, Такая организация анализа приводит к возможности его выполения без специальногооборудования (термостата) и подготовки работающих. Регистрацию степени гидропиза субстрата ведут по ско 1564545рости гидролиза желатина, а именно поскорости образования прозрачных пятен под смоченной ферментным раствором фильтровальной бумагой.Способ осуществляют следующим образом.Кусочки фильтровальной бумаги одинаковой площади и толщины смачивают в экстракте протеиназ и быстро накла дывают рядами на матовую сторону фотопластины. Для получения одинаковых кусков бумаги удобно пользоваться канцелярским дыроколом, позволяющим получить кружки бумаги одинаковой площади. Фотопластину накрывают чашкой Петри и помещают горизонтально на рабочий стол. Температурный режим в процессе гидролиза обеспечивают настольной лампой на уровне 25 ф 2 С, при необходимости опуская или поднимая ее.Первый ряд кружков бумаги снимают через 10 мин, последующие - через каждые следующие 5 мин. Реакцию считают законченной при полном раство.рении желатинового слоя фотопластины и появлении на ней прозрачных пятен под одним из рядов кружков бумагИ.В табл, 1 приведены данные о величине активности протеиназ в зависи мости от продолжительности растворения желатина.Продолжительность определения ак" тивности протеинаэ не превышает3550 мин.П р и м е р 1. Построение калибровочной кривой. Готовят растворы препарата протеолитических ферментов изкреветки с концентрацией О, 1 1,5 мг/мл. Экстракты протеиназ готовят непосредственно перед определением активности. Навеску анализируемого материала, взвешеннуюс точностью до 0,01 г, растирают в фарфоро вой ступке с водойГомогенат наста"О ивают 30 мин в холодильнике при 2 С и фильтруют в пробирку через бумажный фильтр. Полученный фильтрат анализируют.50Кружки фильтровальной бумаги диаметром 5 мм вырезают иэ бумаги с помощью канцелярского дырокола, затем берут пинцетом, смачивают в экстракте протеиназ и быстро накладывают на покрытую слоем желатина сторону фото 55 пластины. На одну фотопластину накладывают пять вертикальных рядов кружков (но три кружка в одном ряду). фотопластину с кружками накрывают чашкой Петри во избежание высыхания экстракта, помещают на рабочий стол и выдерживают при 25+2 С. В случае пониженной температуры в рабочем помещении пластину обогревают настольной лампой. Для контроля эа температурой с рядом пластиной помешают термометр. Для остановки реакции точно через 10 мин пинцетом снимают первый ряд бумажных кружков, Последующие ряды кружков бумаги, смоченной экстрактом протеиназ, снимают через каждые 5 минеРеакцию считают законченной при полном растворении желатинового слоя фотопластины и появлении на ней про" зрачных пятен под одним из рядов кружков фильтровальной бумаги. Продолжительность реакции фиксируют, После снятия всех кружков пластину ополаскивают в кристаллизаторе с водой комнатной температуры и удаляют влагу фильтровальной бумагой. Для каждого иэ исследуемых растворов используют отдельную фотопластину.Параллельно проводят определение протеолитической активности по модифицированному методу Аксона.При построении калибровочной кривой или калибровочной таблицы величину интервала можно изменять с заданной степенью точности путем варьирования интервалов между наблюдениями, концентрации ферментного раствора и температуры проведения реакции. Таким образом, чувствительность метода предусматр; вает требуемую реальность условиями степень точности.П р и м е р 2, 1 г ферментного препарата иэ креветки, взвешенный с точностью до 0,01 г, диспергируют в 9 мл воды, настаивают 30 мин в холодильнике и фильтруют через бумажный фильтр в стеклянную пробирку,Определяют разведение1+ 9С = - -" -- - = 101(удельную массу воды принимают равной 1,0 г/см ) .ЭИз фильтровальной бумаги вырезают с помощью канцелярского дырокола кружки диаметром 5 мм.Кружки берут пинцетом, смачивают в фильтрате ферментного раствора, накладывают на матовую сторону фото- пластины, расположенной на горпзон 515тальной поверхности. На одну фотопластину накладывают пять вертикальных кружков (по три кружка в,одномряду). Фотопластину с кружками накры-,вают чашкой Петри во избежание высы-,хания экстракта протеинаэ.Для остановки реакции точно через10 мин пинцетом снимают первый рядбумажных кружков. Последующие рядыкружков снимают через каждые 5 мин.Прозрачные пятна под кружками появились в 4 ряду, т.е. через 25 мин.По табл. 1 определяют активность протеиназ в единице объема Ферментногораствора (ПА 2,3 - 3,5 ед/см ). Впересчете на 1 г препарата ПА 23 -35 ед/г.П р и м е р 3. 0,5 мг препарататрипсина, взвешенного с точностью до0,01 г, диспергируют в 10 мл воды,настаивают 30 мин при 4 С, Фильтруютчерез бумажный Фильтр,Определяют разведение 10000 + + 0,5/0,5 = 20000,Определение активности проводят также, как описано в примереПрозрачные пятна под кружками смоченной Ферментным раствором бумаги появляются через 45 мин. По таблице определяют активность протеинаэ в единице объема раствора трипсина (ПА О, 4 - О, 6 ед/см ) . В пересчете на 1 г трипсина ПА 8000 - 12000 ед/г.П р и м е р 4. 5 г измельченных внутренностей зубана, взвешенных с точностью до 0,01 г, растирают в Фарфоровой ступке с 10 мл воды. Гомогенат настаивают 30 мин в холодильнике и Фильтруют.Разведение 5 + 10/5 = 3Определение активности проводят . также, как описано в примере 1. Прозрачные пятна под кружками смоченной экстрактом Фильтровальной бумаги появились в 9 ряду, т.е. через 50 мин, По таблице определяют активность протеиназ в 1 см : 0,3 - 0,4 ед/см , что9 составляет с учетом разведения внутренностей зубана ПА 0,9 - 1,2 ед/г.П р и м е р 5. 1 г протосубтилина растворяют в 9 мл воды, диспергируют, настаивают и Фильтруют в пробирку.Определение активности проводят также, как в примере 1.Прозрачные пятна появились в 1 ряду, т.е. через 10 мин. Это значит,64545 6что ПА В 8,37 ед/см. С учетом разведения определяют ПА83,7 ед/г.П р и м е р 6 (контрольный). Наматовую (платиновую) сторону фотопластины, расположенной на поверхности рабочего стола, наносят микропипеткой0,2; 0,4; 0,6 мл биологической жид"кости креветки. На одну сторонуФотопластины наносят пять вертикальных рядов капель (по три каплив одном ряду) и наблюдают за появлением прозрачных пятен под каплями,Через 50 мнн наблюдают образованиепрозрачных пятен. К этому моментубиологическая жидкость подсыхает,сохраняя постоянный диаметр пятна,соответствующий диаметру растекшейсякапли.20 В табл. 2 приведены результатыопределения протеолитической активности Ферментного препарата креветки по методу Аструпа (субстрат - желатин).25 Ход анализа по известному способу позволяет определить присутствиепротеингз в биологической жидкостикреветки, но не дает основание судить о ее величине. Растворы различной концентрации гидролиэуют желатину за.разное время, диаметр пятнапод каплей сохраняет стабильные режимы,Таким образом, преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известным является возможность не только качественной, но и количественнойоценки протеолитической активности,Способ прост и применим в судовых40 условиях, позволяет определять активность протеиназ без использования специального оборудования и с достаточной точностью,45 Формула изобретенияСпособ определения активностипротеиназ, включающий получение Ферментного раствора, проведение Фер ментативной реакции с твердым субстратом с последующей регистрацией степени гидролиза субстрата, о т л ичающий с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения процесса, полученным Ферментным растворомпропитывают куски Фпльтровальной бумаги одинаковой площади и толщиныреакцию проводят путем взаимодействия пропитанной Ферментным раствором ,1564545 8дут по образованию прозрачнык пятенна фотопластине под фильтровальнойбумагой. фильтровальной бумаги с желатиновымслоем, нанесенным на фотопластины,а регистрацию степени гидролиза ве 1 Таблица 1 Протеолитическая активность препарата, мкмоль тирозина/см минз Продолжительнострастворения желатина, мин Концентрацияпрепарата,мг/мл Ряд У 5 Таблица 2 Диаметр, мм.капли пятно под каплей Наносимыйобъем Концентрацияпрепарата,мг/мл раствора,мл 0,2 0,4 0,6 Составитель А. Карякин Редактор Т,Парфенова Техред Л.Сердюкова, Корректор С.Шекмар4 в Тираж 514 Подписное Заказ 1156 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5