Штамм sтарнуlососсus sарrорнутiсus l-1. 10-продуцент уреазы

, Гальвидис иэобретени Всесоюзный научно-исследовательский институт признзимоло гни Заявит 4) М ЯТАРНУОСОССОЯ ЯАРЯОРНУТ 1 СОЯ ПРОДУЦЕНТ УРЕАЗЫ препарата клеток при культивировании в полуиях составляет в- 4,2 евнины.ляется получени роизводственных усл ем 45, в колба лью изобретения Ц о" о и ст бины го культивирования Штамм Ятарйуососсоз заргорйу 0 соз , - 1.10 получен путем целевого селекционного отбора наиболее активных вариантов исходного штамма, С целью отбора возможных болееЪактивных вариантов исходного штамма, ЯтарЬуососсоз заргорЬубсоз 1, - 1 производили рассев бактериальной суспензни на агаризо 1ванную среду в чашках Петри. С целью диф. ференциации истинных вариантов от модификаций производили 4 - 5-кратное пассирова. ние. Анализ естественной изменчивости исал, что штамм предколоний. Внешний вида фотографии,ходного штамма пок ставлен 2-мя типами колоний представлен1-й тип колоний х логическими свойства рактеризуется м и типичными для чно исноет Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению.нового штамма, используемого для получения фермента уреазы.Продуцентами уреазы являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи,5 Т-микоплазмы, а также простейшие и растения. Наиболее распространенными продуцен. тами уреазы являются бактерии, Среди кокков, синтезирующих уреазу известен штамм ЯтарЬу 1 ососсоз заргоффт соз 11.Недостатком данного штамма является низкая уреазная активность. При пересевах штамма ЯтарЬуососсоз заргорЬут 1 соз уровень био синтеза уреазы снижался более, чем на 50%,Наиболее близким к предлагаемому по своим культурально-морфологическим, биохимическим и физиологическим свойствам является штамм ЯтарЬуососсоз заргорЬубсоз- 1 2 т.2 ко известный штамм обладает недоста.ысокой уреазной активностью. Активанного штамма на мг ацетонового штамма-продуцента уреазы с высоко ильной активностью в условиях глу5,0 2,5 2,0 20,0 20,0 980 40 3 99081 ходной культуры 8 тарЬуососсцв яаргорИутсцв 4 - 1, диаметр которых составляет 0,8 - 2,0 мм. После 48 ч инкубации штамм в центре колонии образует выпуклость зеленоватого оттенка. Активность вариантов обрачзующих 1-й тип колоний, выращенных глубин. ным способом составляет 3,4+0,6 ег/мг ацетонового препарата клеток и 8,8 ед/мл культуральной жидкости.Колонии 2-го типа характеризуются мень шим диаметром, достигающим 0,5 - 1,2 мм, более интенсивным блеском, образующийся выступ зеленоватого оттенка в центре колоний носит более расплывчатый характер, На. ряду с усвояемостью углеводов, присущей 15 исходной культуре 8 тарйуососсця яаргорЬу - тсця 1. - -1 приобретена способность усваивать лактозу, Оптимальный уровень биосинтеза уреазы в клетках происходит при рН среды 6,0 - 6,5, в то время как оптимальные значения данной величины, способствующие максимальному уровню накопления данного фермента в клетках исходного штамма. - 6,8 - 7,2, Активность вариантов образующих 2-й тип колоний, колебалась в широких 25 пределах от 6,2 до 14 ед/мг ацетонового препарата клеток. Принимая во внимание на возможность стабильного . образования уреазы на высоком уровне, производили дальнейшую селекцию колоний 2-го типа. В результате проведенной работы был отобран вариант 10, стабильно сохраняющий высокий уровень биосинтеза уреазы при мно. гократных пассированиях, с активностью составляющей 13,6 ед/мг ацетонового препарата клеток.Штамм 8 тарйуососсця яаргорйутсця Ь - 1.10 хранится в коллекции музея культур микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ В - 2346.Штамм имеет следующие характеристики.Морфологические. Шаровидные бактерии. В основном одиночные, нередко образуют гроздья, неподвижны, спор не образуют Величина клеток односуточной культуры на МПА - 0,5 - 1,5 мк в диаметре, Клетки хоро 45 шо окрашиваются разбавленным основным фуксином и метиловым синим, грамположительные.Культурально-физиологические свойства. На МПА после 24-х часов инкубации при 37 С образуют колонии диаметром 0,5 - 1,2 мм, Ко лонии серовато-белые непрозрачные, гладкие, блестящие, с правильными или иногда с лег. ка неправильными краями. После 48-72 ч в центре колоний образуют расплывчатую выпуклость зеленоватого оттенка. В МПД вначале образуют мутность, которая позднее оседа. ет на дно пробирки, Среда становится и остается прозрачной. На поверхности картофеля не растет.Штамм является факультативным анаэробом с оптимальной температурой роста +37 С. Крахмал не гидролизируют. Молоко не пептонизирует. Желатину не разжижает. На среде с минеральным источником азота не растет. Нитраты восстанавливает в нитриты. Усваивает мальтозу, глюкозу, фруктозу, глицерин, сахарозу, лактозу. Не усваивает арабинозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит и инозит. Устойчив к лизоциму. Содержание Г+Ц в ДНК колеблется в пределах 30,5 - 35,0 моль.%. Культура хранится в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым маслом и в лиофилизированной состоянии,П р и м е р . Для хранения и выращивания штамма 8 тарЬуососсця яаргарЬутсцв Ь - 1.10 используется среда следующего состава: Натрий хлористый, гНатрий азотнокислый, гКалий фосфорнокислый однозамещенный, гФерментативныйгидролизат дрожжей, гКукурузный экстракт, млВода, мл сФерментативный гидролиэат дрожжей и кукурузный экстракт суспензируют в 1,5 объеме воды от конечного объема среды, 30%-ным растворов едкого патра доводят до рН 6,0 - 6,5 и стерилизуют при 80"С в течение 20 мин, После охлаждения раствора до комнатной температуры, с целью удаления нерастворимых частиц центрифугировали при 4000 об/мин 40 мин. Надосадоч.ную жидкость водой доводят до конечного объема среды и вносят оставшиеся компонен ты, Вторичнуюстерилизацию полученного раствора производят лри 135 С 40 мин.Для оживления штамм 8 тарЬуососсцв вар - горкнутсця , - 1. 10 засевают на агаризованную среду с чашках Петри и инкубируют при 37 С в течение 20-24 ч.В лабораторных опытах оживленную культуру засевают в 750 мл колбы, содержащие100 мл питательной среды и выращивают на качалке при 180 об/мин при 37 С в течение 20-24 ч.При культивировании в ферментерах посевным материалом служат клетки, предварительно выращенные в колбах на качалке в течение 10 - 12 ч. Выращивание производят при аэрации 8 м/ч, 37 С в течение 20 - 24 ч,рН в процессе культивирования не поддерживают. Контрольным штаммом во всех опытах5 990813 6служит штамм ЗтарЬуососсцз заргорЬубсцз такое количество фермента поИ действием-1. которого выделяется 1 мкмоль аммиака.заВ процессе выращивания определяют уреаз мин при 30 С,ную активность в высушенных охлажденнымацетоном клетках. Иэ веса ацетонового пре 5 Было установлено, что максимальное иапарата клеток рассчитывают уровень уреазной копление уреазы в клетках, данного штамма.активности в мл культуральной жидкости выращиваемых как в колбах так и в ферАктивность уреазы определяют колориметри- ментере происходит от 12 до 18 ч. Резульческим методом с использованием реагента таты испытаний предлагаемого штамма пред.Несслера. За единицу активности принимают 1 о,ставлены в табл, 1,Таблица 1 пособ культив Используемый штамм Вес ацетонового препаратаклеток 100 млкультуральнойжидкости реазная активность, ед Количествопытов а мг ацетоноого препарата а мл культуральной жидкости Зт. заргорЬубсцз 1 -1 3,9 й 013,6 й 1,9, 25 колбах Зт. заргорЬуМсцз 1.-ЦОЗт. задгорЬутсцз 41 олбах 9,6 В ферментер 240 13012,2 реазнуюБелокзуя втипов ы надосадочныи жидкости измеряют у активность и концентрацию белка. определяют методом Лоури. Исполь"качестве органического осадителя э спирт из клеточного экстракта выдферментный препарат уреазы. культуетки4000 об/мин взвешенисполь.0,1 -ют ентв табл. 2.ца 2 ченные данные представленьТабл н, и Уреазная активность, ед Вес биомассы, г/л Используемыи штамм оличестопытов белк На мл куль,На мг фертуральной ментного п жидкости па рата рмен кл м экст 1,5 46,Ы 2,0; 1624 заргорЬубсцз 1, -задгорЬут 1 сцз0+24,0Х 90,0 Ы Как видно Осцз ,- 1,10 капливает в дв исходный штаном экстрак но в 4 раза ность в клет мма 1В конце каждой ферментации изральной жидкости бактериальные клвыделяют центрифугированием при 1в течение 30 - 40 мин. Собранные иные клетки разрушают механически,зуя стеклянные шарики диаметром0,4 мм, Полученный гомогенат клетрифугируют ири 14000. об/мин 40 м штамм ЗтарЬу 1 ососсцз заргорЬу в культуральной жидкости наа раза больше уреазы, чеммм ЗтарЬуососсцз заргорЬуМсцз фическая активность в клеточе нового штамма приблизитель - 5 превышает специфическую актив- очном экстракте исходного Использование штаммагорЬу 0 сцз 1- 1.10 позволповысить уреаэную активментного препарата и в 5активность выделенной урес использованием исходнососснз заргорЬутсцзи культивирование штаммне меняет материальных и ЗтарЬу ососсцз ааряет в 3 2 раза ность сухого ферраз .специфическуюазы, по сравнениюго Штамма ЗтарЬуо1. Выделение уреазы а в ферментерахтрудовых затратСоставитель И. ПриваловаТехред Т.Маточка Корректор У, Пономаренко Редактор Г. Волкова Заказ 57/37 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул, Проектная, 4 990813 8на производство данного фермента по срав. во ВНИИПЭ иэ клеток 8 тарЬУососсцв варгонению с использованием исходного штамма РЬутсцв Ь - 1.10 составляет 30000 руб.8 тарпУОсоссцв варгорпУтсцв 1 - 1, поэтомуприменение нового штамма позволяет снизить удельную (руб-ед. уреазной активности) э Штамм 8 тарпУососсцв варгорпУтсцв 4-1 10 себестоимость производимой уреазы. Себесто. (коллекция Музея культур микроорганизмов имость уреазы выделенной из клеток 8 тарЬУ- института ВНИИгенетика, коллекционный ноососсцз варгорЬутсцв- 1.10 составляет мер ЦМПМ В - 2346) - продуцент уреаэы.0,05 руб/1000 ед. по сравнению с 0,10 руб/ Источники информации,1000 ед ферментного препарата, выделенного О принятые во внимание при экспертизе из исходного штамма, По имеющимся запро, Чап МУК апд 8 теУп Р.,1 оцгпа оФ Ье - сам ориентировочная годовая потребность в пега МсгоЬооду, 91,2, 225 - 232, 1975.Х 1 пятилетке - 600000000 ед, Ожидаемая 2, Авторское свидетельство СССР Мв 75986, годовая экономия от производства уреазы кл. С 12 й 15/00, 1979 (прототип),