Штамм ротавируса мышей, для получения диагностических препаратов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 15710 191 .Я 3 С 12 К 7/00 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Шустрова И.Е.,Ермолаева С.Н. Вирусная диарея новорожденных мышей, Методическое письмо, М., 1971, с, 8.Крухтанова Т,А. Изучение некоторых вирусных инфекций лабораторных животных и разработка методов их выявленияДисс. канд, мед. наук, М., 1974. Изобретение относится к области вируологии. сЦелью изобретения является штамм ротавируса мышей, пригодный для получения специфических диагностических препаратов.Штамм ротавируса мышей выделен от больных инбредных 7-12-дневных мышей- сосунов линии ВА В/с из кишечника, селезенки и печени во время вспышки эпиэоотической диареи молодых мышей (ЕОМ) в питомнике лабораторных животных в 1983 г, Выделенный штамм получил наименование ЕОС - по первым двум буквам названия болезни ЕОМ и символа С, указывающего на линию мышей ВА В/с, ставшую источником выделения вируса,Штамм прошел в лаборатории 21 пасаж через организм 5-7-дневных мышей лиии ВА 1 В/с.(54) ШТАММ РОТАВИРУСА МЫШЕЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ(57) Изобретение относится к вирусологии. Цель изобретения - штамм ротавируса мышей, пригодный для получения специфических диагностических препаратов. Штамм получил название ЕДС и депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ % 2113. Штамм используют в качестве ротавирусного антигена для иммунизации животных, а также как вирус- специфический диагностикум для иммунологических реакций. Штамм ЕОС ротавируса мышей депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ М 2113.Штамм ЕОС ротавируса мышей характеризуется следующими признаками.Физико-химические свойства. Вирус я в- ляется РНК-содержащим, Устойчив к воздействию этилового эфира при 4-5 С в течение 20 ч, хлороформа при 18-20 С в течение 1 ч, дезоксихолата натрия в концентрации 1:500 при 37+1 С в течение 1 ч, фреона 113 при 18-20 С в течение 1 ч, тоипсина 0,25-ного при 371 С в течение 2 ч. Устойчивость к жирорастворителям свидетельствует о том,что вирус не содержит липидосодержащей оболочки. Вирус не ингибируется средами со значениями рН 2,5-12,0 при 4-50 С в течение 2,5 ч. Термоустойчив к прогреванию при 37-60 С в течение 1 ч и в присутствии 1 М М 9 С 12 при 50 Св течение 1 ч, при 70 С в течение 30 мин.Вирус устойчив к глутаровому альдегиду в0,3-0,5 -ной концентрации при 22-23 С втечение 4 ч. Вирус инактивируется при использовании 0,5-ного раствора глутарового альдегида через 24 ч и 1-ного раствораи через 0,5 ч.Биологические свойства, Патогенен дляживотных, вызывает инфекцию у нелинейных и линейных 2-10-дневных мышей-сосунов линий ВА В/с, А/Яп, СВА и гибридовН (СВАхС 57 В О 6) при пероральном заражении. Инкубационный период 1,5-3 сут, Признаки болезни у сосунов проявляютсявздутием живота, переполнением желудка,острым энтеритом, некоторым замедлением роста, при осложнениях развиваютсякопростазы, приводящие к смерти животных от кишечной непроходимости.Взрослые самки, вскармливающиебольных сосунов, не имеют видимых изменений во внутренних органах, но являютсявирусоносителями и у них обнаруживаетсявирусспецифический антиген в паренхиматозных органах,Передача вируса. Вирус передается фекально-оральным путем.Контагиозность, Вызываемое вирусомзаболевание контагиозно для мышей.Репродукционная способность. Вирусобладает высокой репродукционной активностью, Репродукция вируса, проходит в цитоплазме, Инфекционный титр вируса длямы шей-сосунов при поорал ьном заражении достигает 10 - 10ИД 50/0,1 мл,Иммуногенность. Вызывает образование вирусспецифических антител, включаяпреципитирующих, при иммунизации кроликов и у мышей-реконвалесцентов.Антигенные свойства. Выявляют антигенное родство штамма ЕОС ротавирусамышей с ротавирусами обезьян (штамм ЗА1) и телят (штамм РМ) при идентификацииего по непрямому методу иммунофлуоресценции (ИФ), в реакции диффузионной преципитации в агаре (РДПА) и по методуиммуноферментного анализа. Штамм ЕОСв испытаниях по ИФ не имеет связи с вирусами гепатита мышей, лимфоцитарного хориоменингита, осповакцины, эктромелии,Сендай.На основании физико-химических, биологических и антигенных свойств выделенный штамм вируса классифицируют иотносят к семейству Реовириде, роду Ротавирус.Выявление свойства полученного штамма ЕОС в отношении его высокой устойчивости к повышенной температуре, липидорастворителям, изменениям РН среды в15 20 25 30 35 40 45 50 55 широком диапазоне обеспечивают штамму способность выдерживать режимы обработки и очистки вируссодержащего материала от балластных белковых веществ и нежелательных контаминантов во время изготовления диагностических препаратов ротавирусного антигена, диагностикума и специфических сывороток,П р и м е р 1, Получение антигена и вирусспецифического диагностикума к ротавирусной диарее мышей.Штамм ЕОС размножают путем заражания рег оз 5-7-дневных мышей линии ВАЕ В/с. Через 5-8 дней после инфицирования на высоте клинического проявления заболевания мышей забивают под эфирным наркозом; извлекают кишечник (и отдельно печень с селезенкой) и измельчают в гомогенизаторе или ступке, затем готовят 20- ную суспензию на физиологическом растворе с добавлением антибиотиков широкого спектра действия, например канамицина и гентамицина 100-200 ед/мл. Суспензию выдерживают 2-2,5 ч при 4 С, центрифугируют при 3000 - 3500 об/мин в течение 30 мин и подвергают очистке фреоном. С этой целью вируссодержащую суспензию смешивают в равных объемных отношениях (1:1) с фреоном 113 и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1,5-2 ч при 20-25 Сдля извлечения фреоном изсуспензии балластных белковых веществ, Для последующей очистки суспензии и удаления фреона смесь центрифугируют при 3000 - 3500 об/мин, После центрифугирования надосадочную жидкость контролируют на стерильность и используют в качестве рота- вирусного антигена для иммунизации животных, а также как вирусспецифический диагностикум для иимунологической реакции диффузионной преципитации (РДПА).Для иммунизации животных используют ротавирусный антиген, изготовленный из кишечника. Для иммунологических реакций в качестве диагностикума используют как суспензии кишечника, так и суспензии печени с селезенкой, обработанные по указанному способу.В целях длительного сохранения рота- вирусного диагностикума очищенную надосадочную жидкость соединяют с 4-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в объемном соотношении 1:1, разливают по 0,5 мл в вакуумные ампулы, подвергают вакуумной лиофильной сушке и используют в реакции диффузионной преципитации в агаре.П р и м е р 2, Получение гипериммунной диагностической сыворотки к штамму ЕОС ротавируса мышей.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Диагностическую сыворотку получают путем иммунизации кроликов очищенным ротавирусом мышей, полученным из суспенэии кишечника после обработки фреоном 113 в последовательности выполнения операций, как в примере 1. Для иммунизации используют кроликов породы шиншилла весом 2,5-3,0 кг.Очищенный вирус смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и после получения эмульсии вводят кролику в область подколенного лимфоузла в объеме 1 мл и 1 мл в 10-12 точек внутрикожно в область спины. После 4- или 6-недельного перерыва проводят реиммуниэацию вирусом с неполным адъювантом в соотношении 1:1 в подколенную область в объеме 1 мл и 1 мл в 12-15 точек внутрикожно в область спины. Спустя 7-10 дней после реиммунизации производят забор крови из ушной вены кроликов.Активность полученной из крови сыворотки определяют непрямым методом ИФ и в РДПА. При получении активных сывороток производят дробное кровопускание в сроки до 20-го дня после реиммунизации.Титры специфических антител гипериммунной диагностической сыворотки в Иф 1;64, преципитирующих антител в РДПА 1:32 - 1;64.П р и м е р 3. Обнаружение антигена (ротавируса мышей) в мазках-отпечатках из патологического материала непрямой иммунофлуоресценцией,Для исследования методом иммунофлуоресценции на обезжиренных предметных стеклах готовят мазки-отпечатки из кишечника, селезенки и печени инфицированных вирусом мышей. Препараты высушивают,фиксируют в ацетоне, наносят на них диагностическую гипериммунную кроличью сыворотку в рабочем разведении, помещают во влажную камеру, затем промывают фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают. Затем наносят флуоресцирующую сыворотку против глобулинов кролика и обработку препарата повторяют указанными методом. Приготовленные препараты исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на сероватом фоне свечения тканей органов, Исследование препаратов в Иф сопровождается постановкой контролей с использованием гетеро- логичных и отрицательных сывороток, В качестве гетерологичных сывороток могут служить сыворотки против вируса гепатита мышей, Сендай, осповакцины, лимфоцитарного хориоменингита и др. Отрицательную сыворотку получают из крови здоровых мышей,С использованием гипериммунной сыворотки по методу иммунофлуоресценции проводят лабораторную диагностику рота- вирусной диареи мышей во время вспышек кишечных заболеваний в питомниках и вивариях и при исследовании экспериментально зараженных животных,П р и м е р 4, Определение антигена (ротавируса мышей) в патологическом материале и антител в сыворотках .крови с помощью реакции диффузионной преципитации в агаре.Испытуемым материалом служат 5- ная суспензия кишечника, печени, селезенки или фекалий на фосфатно-буферном растворе от экспериментально зараженных и естественно больных мышей, а также сыворотки крови реконвалесцентов, Реакцию ставят в чашках Петри с агаровым покрытием, в котором делают лунки в виде звеньев, состоящих из 6 лунок по перифении и одной центральной в каждом звене.Для обнаружения антигена ротавируса мышей в исследуемом материале в центральную лунку вносят диагностическую преципитирующую сыворотку в рабочем разведении, две диаметральные лунки заполняют заведомо положительным ротавирусным антигеном в рабочем разведении, в остальные вносят испытуемый материал,Для обнаружения антител в центральную лунку вносят вирусспецифический ротавирусный диагностикум, в верхнюю лунку наливают положительную преципитирующую сыворотку к ротавирусу мышей, в остальные вносят испытуемые сыворотки,Полученная специфическая диагностическая сыворотка при иммунопреципитации с антигеном ротавируса мышей, а ротавирусный диагностикум при взаимодействии с антителами к ротавирусу мышей вызывает образование линий преципитации в агаре,Проведенные в РДПА испытания дали положительные результаты при исследовании мышей с экспериментальной и естественной ротавирусной инфекцией.При сопоставлении результатов, получднных с помощью методов ИФ и РДПА, выявляют корреляцию данных. Метод РДПА уступает пс чувствительности тесту Иф в 2-4 раза, но более удобен при массовом контроле лабораторных животных, так как позволяет исследовать большее количество проб в единицу времени. Кроме того, установление этиологии заболевания с помощью метода РДПА проще в исполнении по сравнению с Иф и может быть осуществлеЗаказ 1487 Тираж 478 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская нэб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 но на базе неспециализированной диагностической лаборатории практического профиля в непосредственной близости от очагаинфекции. Формула изобретения Штамм ротавируса мышей ГКВ М 2113для получения диагностических препаратов,