Способ получения l-триптофана

(7) Заявител АНА 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕН вину, с опия, аростовы киПрифана в стких целей значительно Изоой п и мн нии крис епениолучен промышлленни гия его выделения, конечного выхода п месеи ходов на его дополнит зи с чем эффективнос га ана оце стадиферм кого препарата,Известен способ покультивирования мутанлеЬастег 1 цт Ядавснещих предшественниковтребующих для ростатнрозин, и резистентные е ческипнемвать о у из аналогов трипалогов феиилалани из реде с глвкозокторов (ЙЕ-ами иофана с куль х 1ретение относится к микробиологичесмышленности, а именно к способу ия незаменимой аминокислоты 1:трлн применяющемся в фармацевтическойенности и медицине прн нриготовсодержащих свободные аминокислоты для парентерального питания, для ния белковых гндролизатов, нспольв тех же целях, а также может именем в качестве добавки для бавания состава кормов в живодноводИз известных микробиологических способов получения 1:триптофана наиболее экономивыгодным является метод с лримене. 15микроорганизмов, способных продуциротриптофан на основе прямой фермента-. ции иэ простых источников углерода и азота без введения в среду предшественников трицтофана, например индола нли антраниловой кис лоты. При этом в качестве источника:углерода используют мелассу, гидрол или технический сахар, в качестве источника азота мочен, Г. /;Вщикжанина,ская, тт. В.Апафеем" .ЮЕр-м)Ггеленки ц;,релекииизмов:" - : также необходимые неральные соли.аллического Е-трипточистоты для медицинсусложняется техноло., приводит к. снижению дукта и увеличению расельную очистку, в свяь любого способа полунивается с учетом стадии выделения кристалличеслучения триптофаа путемтных -штаммов Согуна средах, не содержазтой аминокислоты биотин, феиилаланнн,, по крайней мере, ктофана и к одномуна или тирозина 1 Ц.и источником росто. н) уровень образова-, туральной жидкости9908 3достигает 3,6 г/л за 4 сут культивирования. На среде с мелассой, кукурузным экстрактом и гидролизом соевого широта уровень образования триптофана достигается 3,4-16,8 г/л за 3 - 4 сут культивирования. Кристаллический триптофан в известном способе выделяют с помощью сильнокислэтного катионита с выходом 50% из культуральной жидкости со. держащей глюкозу, как источник углерода. Для сред, содержащих мелассу, показатели, 1 О характеризующие процесс выделения триптофана, отсутствуют, что связано очевидно с недостаточно эффективной очисткой триптофана, от других аминокислот, которые накапливаются в процессе ферментации или присутствуют в исходной ферментационной среде (например, если среда содержит мелассу).Известен также способ выделения триптофана, пз культуральной жидкости, включающий селсктивную сорбцию триптофана на слабоосновном анионите с последующей его десорбцией водой или слабым раствором кислот и повторной сорбцией из этого раст. вора с целью концентрирования на сульфокати- оните в Н+-форме, и обеспечивающий выходкристаллического продукта до 70% в зависимости от требуемой чистоты конечного препарата 12.Недостатками известных способов получения 1-триптофана и способа его выделения из кугьтуральной жидкости микроорганиэ. мов является:потребность в нескольких ростовых факторах для штаммов Сог. ц 1 ц 1 апзсцпзчто вызывает необходимость введения в питательную среду источников этих факторов, в частности гидролиэатов бепка;большая длительность процесса культивирования микроорганизмов 72 - 96 ч;40низкий уровень накопления триптофана на стандартных источниках углерода (глюкозе, сахаре), которые наиболее пригодны для эффективного выделения кристаллического триптофана, тогда как меласса и гидрол относясь к видам сырья с непостоянным составом компонентоВ, влияющих на рост микроорганизмов и биосинтез, не обеспечивают стабильных показателей на стадии ферментации, и снижают эффективность выделения кристаллического продукта высокой степени чистоты вследствие значительных примесей пигментов, минерапьных солей, аминокислот и оксикислот и т.д.;относительно низкий выход (50%) кристаллического триптофана на стадии выделения из культуральной жидкости,Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому 14 4является способ получения 1-триптофана путем глубинного культивирования штаммов Вас 1 цв ацЬт 1 в Ген/и или 2282 на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ростовые вещества и другие необходимые минеральные соли в условиях аэрации среды с последующим вьщелением 1-триптофа. на одним иэ известных способов с помогцью ионного обмена и кристаллизацией аминокислоты 13.Недостатками известного способа являются невысокий уровень накопления триптофана на глюкозе и сахаре и большая продолжительность ферментации(на среде с техническим сахаром уровень образования триптофана достигает 4,6 г/л, на среде с мелассой или гидролом 8,2 - 10,1 г/л за 72 ч культивирования).Целью изобретения является повышение выхода 1.триптофана.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения 1.-триптофана, предусматривающему глубинное культивирование продуцирующих его микроорганизмов вида Вас 111 цв зцЬт 11 в в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ростовые вещества и необходимые минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из культуральной жид. кости с помощью ионного обмена и кристаллизацией, из микроорганизмов вида Вас 111 цв ацЬт 111 з используют штамм Вас 11 цз ацЬС 11 в ВНИИгенетика, при этом в процессе культивирования в среду вводят концентрированную питательную добавку, содержащую источники углерода, неорганического азота и ростового вещества, в количестве, обеспечивающем поддержание концентрации растворенного кислорода в среде 10 - 40%. Сущность способа заключается в культиви. ровании нового штамма Вас 11 цв яцЫк ВНИИгенетика - 15 на питательной среде, со. держащей источники углерода, азота, минеральные соли, в условиях аэрации при пода. че в процессе культивирования питательной смеси с последующим выделением образовавшегося в культуральной, жидкости 1-триптофана ионообменным способом. В качестве источника углерода используют технический сахар. На заключительной фазе роста через 12 - 30 ч после начала ферментации в ферментер дополнительно вводят питательную добавку, содержащую источник углерода азота и ростовое вещество таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода не превышала 4990814 5Использование нового штамма ВНИИге.нетика 15 в сочетании с введением подпиткив ходе ферментации позволяет увеличитьскорость биосинтеза 1:триптофана и повыситьуровень его накопления в среде с использованием сахара (нли сахарозы) в качествеисточника углерода. Через 48 ч культивирования при 37 С уровень накопления 1:триптофана в культуральной жидкости достигает10,8 г/л. При выделении .-триптофана последовательно используют слабоосновной анионит конденсационного типа и сульфокатионит в Н-форме. Выход кристаллического, 1.-триптофана составляет 65 - 75%.Новый штамм Вас, ацЬЫа ВНИИгенетикаполучен из известного штамма Вас,вцЬМи.Генпутем ступенчатой селекции, включающей обработку клеточной суспензии мутагенным фактором й-метил-й-нитроэо-й-гуанндином(концентрация 200 мг/мл, 2 Оэкспозиция 20 мин) и получение мутантов,резистентных к структурным аналогам аминокислот. На 1 ступени отбора обработанныемутагеном клетки штамма Ген - 3557 быливысеяны на минимальную среду, содержащую 25аналог гистидина 1 - 1.-метнлгистидии в концентрарии 5 мг/мл,Среди выросших резистентных колоний былотобран штамм 924, клетки которого послевоздействия мутагеном были высеяны на зсреду, содержащую следующую смесь аналогов триптофана, фенилаланина, тирозина:5-фтортриптофан (2 мг/мл), феннлаланигидроксамат (0,5 мг/мл) и тирозингидроксамат(2,5 мг/мл). Из числа колоний, резистентныхи указанной смеси аналогов аминокислот,был отобран штамм 22 - 13. Клетки штамма22 - 13 были снова обработаны мутагеном ивысеяны на среду, содержащую смесь техже аналогов аминокислот, но в концентрации 2,5 мг/мл, 0,5 мг/мл, 2,5 мг/мл соответственно. Из числа колоний, резистентныхк указанной смеси аналогов, бьш вьщеленштамм ВНИИгенетика,В табл. 1 приведены сравнительные данные45об уровне накопления триптофана при ферментации в колбах на среде с сахарозой у исходного штамма Гени нового штаммаВНИИгенетика, В указанных условиях выход триптофана в конце ферментации у ноЮвого штамма ВНИИгенетикапревышаетвыход аминокислоты .у исходного штаммана 45%.Высокий уровень накопления -.триптофана(9 - 11 г/л) у штамма ВНИИгенетика.15 может быть достигнут за 48 ч при культивиро 55вании в ферментере с введением питательнойподпитки в ходе ферментации согласно предлагаемому способу. бШтамм ВасИца ааЬОИа ВНИИгенетика.15 хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика", где он депоннрован под номером ЦМПМ-В. 2306. Штамм ВасНив вцЬПЬ ВНИИгенетика. 15 имеет следующую культурально-Морфоло- гическую характеристику.Грамположительная спорообразующая папочка. Колонии на мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации при 37 С достигают 4-5 мм в диаметре, сплошные, круглые, сйзрезаннымкраем, поверхность гладкая, со слабой, радиальной по краю и концентрической в центре исчерченностью, цвет серовато-белый. Посев штрихом на мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубацин при 37 С дает умеренный рост, штрих-широкий с мелкозубчатым краем, запах - характерныйконсистенция - маслянистая, цвет - серовато-белый. Рост на мясо-пептонном бульоне после 1 сут, ннкуба- . ции при 37 С характеризуется умеренным помутнением среды без образования пленки, запах - характерный, осадок - скудный, тягучий нри встряхивании.На агаризованной минеральной среде Сцицайзена с глюкозой колонии после 3-х суток ннкубации, при 37 С достигают 1,5 - 2,0 мм в диаметре, сплошные, круглые, с гладкой, блестящей поверхностью, .грязнобелого цвета, структура однородная.Рост на жидкой минеральной среде ицайзена (24 ч инкубации при 37 С на к чалке) характеризуется слабым струйчатым помутнением. среды, Рост штамма ВНИИгене,- тикана жидкой или агаризованной минимальной среде не стимулируется 1.-фенилаланином, в отличие от исходного штамма Ген. Способ осуществляют следующим образом. Штамм Вас. зоЬОв ВНИИгенетнка.15 выращивают в течение суток на агаризованной среде (МПА), пересевают в колбы со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и необходимые минеральные соли, и выращи. вают в. течение 18 - 24 ч на качалке, обеспечивающей достаточную азрацию при температуре 28 - 30 С в асептических условиях. Полученный посевной материал в количестве 1 - 10% передают в ферментер состерильной питательной средой, содержащей источни. ки углерода, азота, ростовых веществ и необходимые минеральные соли, В качестве источника углерода используют сахарозу или содержащие ее субстраты, например техничес. кий сахар, в качестве источника азота - моче- вину, в качестве источника ростовых веществ - кукурузный экстракт.990814 20,02,25 40 55 7Ферментер снабжен датчиком концентрациирастворенного кислорода, устройством дляаэрации, перемешивания, поддержания темпе-,ратуры, отбора проб и подачи дополнительной питательной добавки в ходе ферментации,Ферментацию осуществляют в течение 48 чпри температуре 35 - 40 С, рН 6 - 8, непрерывной аэрации и перемешивании,В начале процесса ферментации в связи синтенсивным ростом биомассы концентрация 10растворенного кислорода падает, а затем начинает возрастать, Через 12-30 ч после начала ферментации при увеличении концентрации растворенного кислорода р 02 выше 40%от насыщения воздухом при атмосферном давленни в фсрментационную среду вводят концентрированную питательную добавку, содержа.щую источник углерода, азота, ростовых ве.ществ. Добавку вводят таким образом, что бы концентрация растворенного кислорода щрО не превышала 40%. За 48 ч ферментацииконцентрация 1.-триптофана в культуральнойжидкости достигает 9 - 11 г/л. Полученнуюкультуральную жидкость обрабатывают последовательно известковым молоком и серной у 5кислотой с целью отделения биомассы путемфильтрации или центрифугирования. Затемвыделение кристаллического 1.-триптофана осущсствляют известным способом, с последовательной сорбцией 1. триптофана на слабооснованном анионите конденсационного .типаи сульфокатионите а Н-форме.П р и м с р 1 (контрольный) . Для приготовления посевного материала суточнуюкультуру штамма Вас, ацЫПа ВИИИгенетика.3515, выращенную на агаризованной среде(МПА), псресевают в колбы емкостью 750 мл,содержащие 40 мл стерильной посевной среды.Посевная среда имеет следующий состав, %:Сахар технический 5,0Кукурузныйэкстракт (потехническому весу) 2,0КН,Р 04 0,06К 2 111 04 0,14рН=7,0 - 7,2Среду стерилизуют при 0,8 атм в течение30 мин. Посевной материал выращивают18 - 20 ч на качалке (200 - 300 об/мщу) при28-30 С. Для засева ферментационной среды посевной материал добавляется в количестве 5%.Ферментационная среда имеет следующий состав,о.Сахар технический 10,0Кукурузный экстракт(по техническому весу) 3,0КН РО, 0,06 К, НРО 4 0,14Мд 80 ф 7 Н 20 0,1Р 1 аС 0,015Мочевина 0,5рН=7,0 - 7,2Ферментационную среду без мочевины стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин. Мочевину в виде 25 о-ного раствора стерилизуютотдельно при 0,5 атм в течение 30 мин идобавляют в основную среду перед посевом,Ферментацию проводят методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера(емкостью 250 мл с двумя отбойниками),содержащих 20 мл среды на качалках(400 об/мин) при т = 37 С в течение 48 ч.Через 48 ч в культуральной жидкости накал.ливается 7,5 г/и -триптофана,П р и м е р 2. Штамм-продуцент, составпосевной и ферментационной сред тот же,что и в примере 1. В отличие от способаведения ферментации, описанного в примере1, культивирование проводят с дробной подачей подпитки в зависимости от содержаниярастворенного кислорода в среде.Подпитка имеет следующий состав, %:Сахар технический 50,0КукурузныйэкстрактМочевинарН=7,2 - 7,3Подпитка стерилиэуется при 0,8 атм в те.чение 30 мин. Мочевина стерилизуется отдельно в виде 25 о-ного раствора при 0,5 атмв течение 30 мин. В ходе ферментации содержание растворен. ного кислорода (р 02) в среде снижается до нуля, затем возрастает, При повышении р 02 до 40% подается подпитка в количестве, вызывающем снижение р 02.Подачу подпитки начинают через 19 - 30 ч ферментации. Объем затраченной подпитки 44 мл, Динамика накопления триптофана в культуральной жидкости показана в табл, 2.П р и м е р 3. Штамм-продуцент, состав посевной и ферментационной среды и под. пятки тот же, что и в примере 2, Фермен. тацию ведут в ферментере объемом 30 л, коэффициент заполнения 0,5, Условия перемешивания и аэрации обеспечивают сульфитное число 3,5 г Оз/л ч, В ходе ферментации содержание растворенного кислорода (р 02)снижается до нуля, затем возрастает, При до. стижении значения рО, равного 40%, включают подачу подпитки, которую, подают ваппарат до тех пор, пока р 02 не снижаетсядо 15%. Подачу подпитки начинают на 28 ч9 990814 10ферментации. Объем подпитки, потребленныи довательно соедино е еиных колонн 3 ИА 1 КУв течение ферментации, равен 450 мл.и 2 КУ (колонна 2 ИА отсоедиияется и сорПосле 48 ч ферментации в культуральной бент регенерируется)жидкости накапливается 9,7 . г/л 1.-триптофа- Элюирование триптофофана с колонны 1 КУна, который выделяют следующим образом. ч ведут водно-этанольным раствором аммиака70 г, после об ботки1 л культуральной жидкости, освобожденной . при температуре 70 С, П раот биомассы, с концентрацией . триптофана "богатой" фракции элюата уксусной кислотой9,7 г/л направляют на колонну с 0,250 л и охлаждения до 0 С получают кристаллсорбента ИА - 1 р - слабоосновного анионита:Е-триптофаиа, После высушивания при темпе.конденсационного типа (колонна 1 ИА). 1 Е ратуре 50 С получают 17,2 г Л:триптофанаПеред промывкой к выходу колонны 1 ИА с содержаниемо е жанием основного вещества более99 О. осле описанных опеоаций по выделе.подсоединяют вторую колонну с ИАр (ко%.После олонна 2 ИА содержит.0,250 л сорбента), По нию триптофана из трех литров культуральокончании промывки колонну 2 ИА отсоеди- ной жидкостиной жидкости на колоннах 3 ИА и 2 КУняют, а к выходу колонны 1 ИА подсоеди. 1 остается сор ро р фт со би ванный т вттойан в колиняют колонну с сульфокатионитом КУ - 2 - 8 честве 35 г, Триптофан также содержитсяых акци аммиачного элюата и(колонна 1 КУ содержит 0,1 л. сорбента) и в бедных фр 9 хв аммиачно-этанольном маточнике полученпроводят элюирование, Промывку колонны1 ИА и элюированне из нее триптофана осу- ном после отделения кристаллов триптофа.ды, соответственно. Дальнейшее элюирование на, который может быть довыделенв послетриптофана из колонныоф 1 ИА т асгво. дующих технологических циклах, о щий выведут раство.ром, выходящим из колонны , ъем 1 КУ, Об - ход трилтофана составляет 70%. Преимуществап дложенного способа состоят в том, чтоная скорость пропускания раствора, цирку- . предлов способе достигается значительная экономияпирующего по системе из двух колонн, состав-д в сляет 0,25 л/ч, продолжительность указанной обессоленной водь,ой воаммиака и этанола засчет того, что малоконцентрированные фракоперации составляет 10 ч,Очередную порцию (1 л) культуруральной . цнн элюата используют в качестве элюентажидкости найравляют на колонну 2 ИА. Пе- в последующих технологических циклах дляред промывкой ко входу колоннынны подсоеди- десорбции .-триптофана с анионита и сульфо 361 ИА а к выходу - третьюкатионита, За счет этого удается также сниняют колонну 1 ИА, а к выходу -одукта при выделении. Позить потери продуктаколонну с ИА - р (колоннл ченные богатые фракции элюата нейтрали 025 л со бента). По окончании промывки лученные г)р ),ИА - зуются уксусной кислотой при охлаждении,колонны 2 ИА дИА во ой колонну 3 отсоедисоеп и этом триптофан выпадает в виде крисняют а к выходу колонны. 2 ИА подсоеди при этом три т)нт во ) взятыйталлов, которые выделяют фильтрованиемняют колонну 1 КУ, Элюент (воду), взятыив количестве 2,5 л, про у рп скают че ез после- и высушивают, аточный ры ИА ,ют для сор ции на колодовательно соединенные колонны 11 М,б- Суммарный выход трипто ана оФ д стигаети 1 КУ. Дальнейшальнейшее элюи вание (пересорро70%. Содержание основного вещества в полуцию) тринтофана из колонны 1 ИАнны ф 0 ченном препарате не менее, а пна колонну 1 КУ ведут, соединяя коло2 ИА и 1 КУ, в замкнутую систему. Сорбент . кристаллиз циик исталлизации не более 9т егенз ации. Предлагаемый способ получения Е.трипто.в колонне 1 ИА подвергают регенерации.фана имеет следующие преиму емущества по сравОчередную порцию культуральиои жиднению с известными способамн:кости (1 л) обрабатывают аналогично выше 3 ИА 4 более высокий уровень накопления трыписанном с использованием колоннтофана на средах со стандартным источником1 ИА (смола отрегенирована, колонна под(9 - 11 г)ь 3 ИА углеводов - сахарозой или сахаром - гсоединяется к выходу из колоннып и и мывке, 2 ИА (подсоединяется ко по сравнению с З,б - 4 б г/л);э исокращенный период ферментации, достигае.входу колонны 3 ИА при промывке и элюиро- со рвве ением питательной д авки ( чЬб (48ИА и и элюировании), "Пересорб- по сравнению с 72 ч);т по соединив к в спосо е усовеб ершенствована стадия выделециютриптофана проводят, д1: птофана что позволяет вю колонну с . ния и очистки 1.-трипт ана, чтовыходу. колонны 1 КУ другуюни уменьшать расходы обессорбентом КУ - 2 - 8 (колонна 2 КУ содержит значительнои степени уме0,1 л сорбента). Таким образом, раствор 5% соленной воды, аммиака и других реагенциркулирует по системе, состоящеи из после- тов на этой стадии,.при 37 С на среде с 10% сахарозы,10 мл среды, г/л 48 ч 68 ч Ген6,1 6,6 ВНИИгенетика7,3 9,6 ГЪ / Таблица 2------ т 12 21 36 10,7 8,6 2,0 6,4 0,17 0,22 0,29 0,232 Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Патент США У 3849251, кл. 195 - 29,олублик. 1974,2. Авторское свидетельство СССР й 745889,кл, С 12 Р 13/22, 1977. 3, Авторское свидетельство СССР Р 480758,кл. С 12 Р 13/22, 1972.Составитель М, ЛаринаТехред Т.Маточка Корректор А, Ференц Редактор Г Волкова Тираж 521 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5 Заказ 57/37 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 При м е чан ие, т - время ферментации;Т - уровень накопления -триптофана;Т/т - скорость накопления.Формула и зобретения при этом в процессе культивирования в среду вводят концентрированную питательнуюСпособ получения 1.-триптофана путем глу- э добавку, содержащую источники углерода,биннсго культивирования продуцирующих его неорганического азота и ростового вещества,микроорганизмов вида Вас 11 ца ацЬт 11 я в в количестве, обеспечивающем поддержаниеусловиях аэрации на питательной среде, содер- концентрации растворенного кислорода вжагцей углеводы в качестве источника углеро. среде 10 - 40%,да, источники азота, фосфора, ростовые вещества и пеобходимьп; минеральные соли, споследующим выделением целевого продуктаиз культуральной жидкости с помощью ионного обмена и кристаллизацией, о т л ич а ю ш, и й с я тем, что, с целью повы.шепия выхода-трипэофана, из микроорганизмов вида Вас 1 ца ацЬт 111 а используютштамм Вас 1 ца БцЬ 11 а ВНИИгенетика,