Штамм аrтнrовастеr species всти-5-продуцент нуклеотидов и рибозо-5-фосфата

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯАОЕОМ СИДЛС Союз СоветскикСоциалистическихРеспублик нн 960258(61) Дополнительное к авт. свид-ву- (22) Заявлено 240481 (21) 3278267/28-13 с присоединением заявки Йо 3278266/28-13 ИМ.Кп.С 12 .Я 15/ООЛ:С 12 .Р 19/30С 12 Х 15/00С 12 К 1/06 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(23) Приоритет -33)УДК 663.18 Опубликовано 23 Р 9.82. Бюллетень М 35 Дата опубликованя описания 230982 ГО 88.81(71) Заявител осковский ордена Трудового Красного Знамениехнологический институт пищевой промышленност 54)ШТАММ АВТНКОВАСТЕВ ПРЕСЕ 5 ВСТИ-ПРОДУ НУКЛЕОТИДОВ И РИБОЗО-ФОСФАТА25 Изобретение относится к микробиологической промышленности у в частности к получению лекарственных препаратов и реактивов нуклеотидов, а так,же основы для их химического и ферментативного синтезов - рибозо-фосфата. и представляет собой штамм, который при определенных условиях культивирования накапливает в среде рибозо-Фосфат гуанинфосфорибозилтранс Феразу ГФРТ-азу и синтезирует из внесенных основанийсоответствующие нуклеозидмоно-, ди- и трибосфаты,В нашей стране нет производства нуклеотижов, а импорт их ограничен высокой стоимостью. Химический синтез этих соединений дорогой. многоступенчатый, требует сложного оборудования. Перспективен микробиологический синтез данных веществ Развитие микробиологического способа получения нуклеотидов и рибозо- -фосфата сдерживает отсутствие стабильного и продуктивного штамма.Известен продуцент нчклеотидов 11 .Однако такой продуцент отличается невысоким выходом и нестабильностью синтеза нчклеотипов, рибозо- -5-Фосфата. Потребность страны в различныхнуклеотидах. их производных, рибозо-Фосфата ГФРТ-азы, испольэуемой дюжая получения ГМФ, непрерывнорастет в связи с развитием исследований в области биологии, медицины.Кроме этого, гуанозинмонофосфорная кислота (5-ГМФ) применяется вкачестве интенсификатора вкуса иповышения питательной ценности различных пищевых продуктов. Внидуее абсолютной нетоксичности в качестве добавок предполагается дальнейший рост потребности в этом соединении. Получение гуаниновых нуклеотидов с помощью ауксотрофных .мутантов в настоящее время представляетбольшие трудности, так как гуаниновые нуклеотиды ингибируют.по принципу обратной связи начальные реакции биосинтеза пуринов с 1 е почо. Поэтому с помощью мутантов можно получать лишь природные нуклеозидмонофосфаты (ГМФ) в ограниченном количестве, а народному хозяйству требуются различные нуклеотиды, иханалоги, применяющиеся в медицинедля лечения злокачественных опухолей. Поэтому актуален поискштам- ЗО ма - продуцента нуклеотидова:также9602584основы для их синтеза, синтеза раэ- и желтоватого цвета. Пигмент в среличных соединений " рибозо-фосфа- де не диффундирует. Среда Гауэе,глита, который также импортируется. ; цериново-аспарагиновый агар, средаНаиболее близким к предлагаемая Сабуро. - к десяти суткам роста обраштамму является отечественный пройу" зуются слабые точечные, прозрачныецент АТФ и незначительных количеств 5 колонии. Среда Чапека с крахмалом -ГТФ СогупеЪас 1 егппп эрес 1 ез ВСТИ- рост слабый, мелкие округлые, бесцвет,3012. ,.ные колонии,Недостатком известного продуцен- Физиологические признакита является то, что при его исполь- По отношецию к кислороду - факульэовании требуется предварительная 10 тативный анаэроб. Оптимальная темпеочистка питательных сред от ионов ратура роста 28-37 С, при .15,41 рост6марганца и цинка, которые сильно ли- слабый, при 4,45 С роста нет. Молокоймитируют синтез нуклеотидов иэ осно-с метиленовым синим не, изменяет. Жеваний этой культурой. Для приготов- латин.не разжижает. Крахмал, клетчатления сред требуется использованиЕ . 15 Ку ие гндролизует. Сероводород, индол,высокоочищенных реактивов, дистилли- Ъцетилметилкарбинол, аммиак не оброванной воды. разует. Нитраты редуцирует до нитКроме того, известный штамм об- ритов. Пробы,на каталазу, уреазу по"ладает нестабильностью синтеза кукле- ложительные. усваивает глюкозу, фрукотидов, не накапливает в среде рибо"тозу, сахарозу, манноэу, ксилозу,эо-фосфат, исключает применение для рибозу, арабинозу, галактозу, лактополучения их дешевых питательных зу, мальтоэу, раффинозу, инозит, дульсред. цит, маннит, глицерин. На глюкозе,целью изобретения является прове" фруктозе, сахароэе образует кислодение поиска и отбор культуры, спо-ты, но не газ. В качестве источникасобной накапливать в среде рибозо- азота использует для роста различные25-5-фосфат аденин- и гуанинфосфорибо- аммонийные соли; многие природныезилтрансфераэ (АФРТ-азы и ГФРТ-аэы), аминокислоты: ранят .штамм прии синтезировать иэ внесенных основа-8 С на косяках с МПА.оний соответствующие нуклеотиды. П р и м е р.1. Ферментация.поставленная цель достигается 30 Посевную культуру. Агг.пгоЬасйегследующим образом. В результате" зрез 1 еэ ВСТИвыращивают в течепоиска и отбора из природных источни-ние суток на качалке (220 об/мин,ков. выделяют штамм, способный накан- при 301 фС) в колбах Эрленмейераливать в соеде рибозо-фосфат и син- на 250 мл с 10 мл среды. Составтезировать из экэогенных оснований 35 посевной среды, % глюкоза 2,0,соответствующие нуклеотиды. Штамм де- пептон 1,0, дрожжевой экстракт 1,0;понирован во ВНиИантибиотиков, регист- ИаС 1 0,3, рН .7,3. Посевной материалоационный номер 1630, эарегистриро (по объему) переносят в ферменван Международной Федерацией коллен" тационную среду, % глюкоза 10;О;ции культур в реестре под 9 337 4 О КНРО 4,1,0;КНРО 1,0; Мя 5047 Н 0 10;Характеристика штамма Аг 1 ЬгоЬасГег СаС 12 НО. 0,01; пептон 1,0; дрожзрес 1 ез ВСТИ. жевой экстракт 1,0; мочевина 0,6;Морфологические признаки. рН 8,3. Мочевину стерилизуют приБактерия, клетки которой располо,5 ати, 15 мин, рН сред доводятжены попарно, Ч-образно, встречают 5 н,КОН до стерилизации и стерилися и одиночные клетки, с округлен- зуют при 1 ати, 20 мин. Выращиваниеными концами, размеры 0,6-1,0 х , в течение 3 сут. проводят в такихх 1,.2-3,0 мкм,"Жгутиков нет, неподвиж- . же условиях, как и посевной материная. Граммположительна некислото- ал. Для выделения рибоэо-фосфатаустойчива. Запасные вещества представ- используют культуральную жидкостьлены волютиновыми зернами (полифос-пятисуточной культуры. Для синтезафаты), которые к пяти суткам ростануклеотидов в трехсуточную культуна МПА располагаются в клетке поляр- ру вносят в качестве их предшестио, придавая ей "гантелевидную" форму венника сухой препарат основания . -МПА. Рост хороший, после двух суток гуанин хлорид иэ расчета 3 мг/млроста при 30 С образует колонии 05- 55 среды и продолжают иикубацию на ка 0,8 см в диаметре, желтоватого цве-чалке еще двое суток. Одновременнота, с ровным краем, выпуклые, непроз" с гуанином в среду вносят ксилолрачные, с ровной поверхностью, матс- иэ расчета 1% (по объему).вые, маслянистой консистенции, легко Определение нуклеотидов.суспендируется водой МПБ. Рост, уме Культуральную жидкость, после .ренно мутный, пленку на поверхности удаления клеток центрифугированиемне образует, осадок рыхлый, белый при 50000 х, 10 мин обрабатываютаморфный. На среде с отваром Хоттин- хлорной кислотой 1,2 н, нейтрали-гера к трем суткам роста образует ко- зуют 30-ной КОН и хроматографионии 1,0-1,5 см в диаметре, желтого 65 руют на бумаге "РМ" в системерастворителей иэомасляная кислота - и 6 и м е р 4. Условия фермента 1 н. аммиак - ледяная кислота ции такие же, как и в понмере 1,1051,. рН 3,8, нисходящая, при 28 С. только вместо гуанина вносят урацил.йПятна нуклеотидов, соответствующие Выход УМФ уридинмонофосфорной кислосвидетелям на хроматограмме, выре- ты) 2.0 мг/мл.зают и элюируют в течениз суток 3 мл П р и м е р 5. Условия Ферментации0,1 н. НС 1, Количество нуклеотидов : такие же. как и в примере 1, толькорассчитывают с переводными коэффици- вместо гуанина вносят соответствуюентами Уф-поглощающих элюатов при щие нуклеоэиды вместо гуанина260 нм. гаунозин, аденина - апенозин. гипоксанИдентификацию отдельных нуклеоти- О тина - инозин. Урацила - уридин, выдов проводят путем сравнения. их ходы образовавшихся АТФ, АДФ, АМФ,ЙЕ с .КЕ свидетелей на хроматограм- ГТФ, ГДФ, ГМФ, ИМФ, УМФ были вышеме, спектрофотометрическими методами незначительно.(Уф-спектры), химическими - опреде- П р и м е р 6. Ферментация. Посевление рибоэы (орцинольным методом 15 ную культуру АгйЬгоЬасгег зрес 1 езпо Мейбаум), фосфора (по фиске-Суб- ВСТИвыращивают в течение сутокбароу), основания. (спектрофотомет- . на качалке (220 об/Мин, при 30+У)рически при 260 нм), определение иА в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл.молярного соотношения. Содержание с 10.мл среды следунхцего состава, Ънуклеотидов, образовавшихся.,в. куль- ;р глюкоза 2,0; пелтон 1,0, мясной эксттуральной жидкости, выражают в . ракт 1,0, МаС 1 0,3, рН 7,3. Посевноймг/мл среды. . " , материал (10 по объему) переносятВыделение. рибозо"фосфата. в ферментационную среду, В глюкозаКультуральную жидкость, свободную 10,0, КНРО 4 1,0 КН 4 Р 041,О,от клеток, обрабатывают активирован МАМБО 7 ЙО .1,0; СаС 1 2 Н,О 0,01, .ным углем СА" Фирмы Ыдпа ф длямясной экстракт 0,8; мочевина 0.,6,. удаления белков и УФ-поглощакщих . пептон 0,5; рН 8,3. Мочевину стери. веществ нуклеиновой природы. Адсорб- ,лизуют отдельно при 0,5 ати,цию проводят на холоду при перемеши мнн, рН сред доводят 5 н. КОНвании в теЧение часа. Контроль за ад-ЗО до стерилизациии стерилизуютпри 1 ати,сорбцией осуществляют, измеряя погло.- 20 мин. Выращивание в течение 3 сутщение при 260 нм. Уголь удаляют цент- проводят в тех же условиях, что и порифугированием при 10000 х, 30 мин севной материал. Из трехсуточной кульСупернатант используют для выделениятуральной жидкости удаляют клетки.рибозо-фосфата ионообменной хрома- центрифугированием при 10000 хтографией на колонке с Дауэкс, . 15 мин. Супернатант используют .для(Формиатная Форма) по методу флакса. Фракционирования охлажденным до -15 С,Рибозо-фосфат может быть выделен этанолом до 50 насыщения, для чегоиз.элюатов в виде бариевой соли. Для приливают медленно равный объем этаэтого фракции, содержащие рибозо-. 5-. иола. Осадок собирают центрифугирова"-фосфат, объединяют и упаривают на 40 -нием при 5000 х ф, 10 мин, растворяроторном испарителе до нужного объема ют в 50 мМ трис-НС 1 буфере, рН 7,5.: при температуре не выше 30-350 С, под- Определение активности аденин- ищелачивают до рН 8,5 гидроокисью . гуанинфосфорибозилтрансферазыбария, затем на холоду добавляют трех- (АФРТ и ГФРТ) проводят по Шлоссбергу.кратный объем этанола, осадок со- . 45 В работе используют меченые соепи"бирают центрифугированием при , ненйя В/О "Изотоп - аденин фС (удель 5000 х , 10 .мин, промывают этанолом, ная актявность. 4,1 10 имп/мин/мкм),эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. гуанин- С (удельная активность 4,6 х4К пяти суткам культивирования проду- х 106 имп/мин/мкм). Счет радиоактив"цента в определенных условиях в сре- яности осуществляют на сцинцилляцион"де накапливается до 4 г/л рибозо- ном счетчике СБСс эффективностью-5-фосфата. счета л 60Активность Ферментов выражают в нм синтезированного нуклео"П Р И М Е Р 2. УСЛОВИЯ ФЕРМЕН- ЗндМОНОфосфата за минуту., на мг белтации такие же, как в примере 1,только в качестве предшественникавносят аденин. Выход АТФ (аденозин- Препараты нуклеотидов необходимтрифосфооной кислоты 1 2,0 мг/мл, для различных областей народного хо-,АДФ (аденозиндифосфорной кислоты) . зяйства, медицины. биологии, синтеза0,5 мг/мп,. АМФ (аденозинмонофосфор- различных соединений. Так, ГДФ иеной кислоты) 0,5 мг. мл. .6 ф обходима ддя синтеза полигуаниловойП р и м е р 3. условия фермента- . кислоты, обладающей высокой противо"ции такие же, как и в примере 1, вирусной активностью. В нашей странетолько в качестве предшественника АТФ получают-из мяса, а остальные нуквносят гипоксантин. Выход ИМФ (ино- , леотиды и рибозо-фосфат импортируют"зинмонофосфорной кислоты) 3.0 мг/мп. 65 ся по очень высокой стоимости. Расту960258 ИМФ 3,0 г/л, иэ урацила 2 г/л, накапливает в среде Ферменты пуринового обмена - аденин и гуанинфосфорибоэилтрансферазы с активностьюк 72 ч ферментации 18 нммС АМФ 5 в минуту на мг белка и 64 вм С 4ГМФ в минуту на мг белка. Составитель М.ЛавинаРедактор Л.Лукач ТехредМ.Гергель Корректор Е.Рошко Заказ 7149 /31 Тноаж 505 ПодписноеВНИИПИ Госудаоственого комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035. Москва. Ж. Рачшская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 щие потребности страны в нуклеотидах и рибозо-фосфате не удовлетворяются их производством. Предложенный штамм АггпгоЬасФег эрес 1 еэ ВСТИпозволяет получать природные нуклеотиды АФРТ-азы и ГФРТ-азы и рибоэо-фосфат, используя дешевые среды, которые в дальнейшем могут быть заменены на более рентабельные комплексные среды, так как синтез нуклеотидов и рибозо-фосфата предлагае мым продуцентом не зависит от присутствия в среде ионов марганца и цинка.Штамм в определенных условиях на,капливает в срвде к пяти суткам , 15 культивирования до 54 г/л рибозо- -5-фосфата. При внесении соответствуюших оснований или нуклеоэидов синтезирует: из аденина - АТФ 2.0 г/лАДФ 0,5 г/л", АМФ 0,5 г/л; иэ гуанина - ГТФ 2,5 г/л, ГДФ 0,8 г/л ГМФ 0,5 г/л, гипоксантинаФормула иэобоетенияШтамм АгййгоЬасйег эрес 1 еэВСТИ(депонирован"во Всесоюзйомнаучно-исследовательском инсти"туте антибиотиков, М 1630)продуцент нуклеотидов и рибозо-фосфата.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское. свидетельство СССР9 395082, кл, С 12 Р 19/32. 1971.2. Автооское свидетельство СССР9 726161 кл. С 12 Р 13/06, 1977.