Способ получения азотсодержащего антибиотика

О П И С А Н И Е ц 1517265ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик 61) Доиолннтель к патент л, С 12 2 22) Заявлено 30.07.73 (21) 1954501/28 Приоритет,07. 7 Государотвонный комитат 6 оввта Мнннотроо СССР оо долам нзоорнтоннй н открытий.06,76 вюллетеиь21 45) Дата опубликования описания 16.09.7(72) Авторы изобретени нос траяныи Вильям Мак"Зли Лилли анд Компани (СШР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОПЕРЖАШЕГОАНТИБИОТИКА Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к новомуспособу получения азотсодержащего витиюбиотика.Предлагаемый способ получения азотсодержащего антибиотика звктпочается в том,что культуру ЛЮтторц 1 еа,"сйррепйь УМЕ,содержащей ы точннки углерода, азота инеорганические соли, и выделяют целевой Опродукт известными прием ам и,или ин редставляет вещество,интети ет анод роткие. ые, диа- недели с 5032638 о выратходящих аЬровой ацол): А Г с ь из сла , звтемлоциях с А нтибиотик,атвноле, высши и метвцолеб оль ц ц нстве пнртах Полученный антибиотикбой белое аморфное твердо"1растворяетс органическ;ы растворителей и плохо рвстввряется в воде.При подкожном введении мышам антибиотик обнаруживает антимикробное действие и Ио. против экспериментальныхбатеривльныхифекий,Антибиотик способен тормозитьгбирова"ь рост мцкооргвизмов, вызывающих развитие заболеваний зубов,При добавлении 45,4 г антибиотика на, 1 т корма средний прирост цыплят через10 дней составляет 159 г (средний прирост у контрольных животных 148 г),Морфология,Гифы на синтетической или поческой агаровой среде сначала кослабо разветвленные, септированметром 0,2-1,2 мкм, Через двеколонии могут состоять из четженных масс вертикальных гиф, о; от более глубоко погруженных всреде: иф,бо слизистой массы коротких гиф51726513четко выраженной массой вертикальныхгиф мицелий образует компактный слабоподнимаюшийщ жесткий (кожеподобный)рост. В колониях с корЬткими гифами мицелий образует куполоподобный рост, Воздушные гифы не образуются ни в какойсреде. На поверхности куполообразных ко=,лоний образуется большое есоличество спора нгий,Спорвнгии Образуются в избытке на еео.лусинтетическом агвре Аепео- Генссена, Онипоявляются через 2- надежде инкубациипри 17-19 оС, Спорвеегий находится отдель=но на очень коротких спорангиофорах, Спорангий может иметь сферическую, субсфериЬческую или слегка лопастную форму, сравнительно невелик, диаметром 4-10 мкм, Спорангий содержит 20-.40 субсс,ерическихспорангиоспор, расположенньех. в виде одногоили нескольких витков з снорвнгии. Спораее 20гиоспоры имеют примерно 3 .:еесм в диаметрев зрелом состоянииастрескивание снорангия означает полную щпе частичную дезинтеграцию спорангия. Е-.ерез 10-15 минпосле помещении в. воду спорангий начинаетнабухать, приобретая типичную сферическуюформу, и затем выделяет споры при дезин- .теграции стенок.Внешн ви н суее,Агароввя среда Чапека, МХороший рост. В точке инокуляаии обра,зуется колония диаметром 0,75 см зв 4недели. Воздушных гиф нет. с.оееоееия обьечно плоская с небольшим центральным пиком.Цвет колонии умеренно оранжевый. Спорангии наблюдаются лишь в редких случаях.Пептоно-агаровая среда Чапека.Хороший рост. В точке инокуляции об.разуется колония диаметром около 1,0 см атее за 4 недели. Отсутствие воздушных гиф.Колония слабо растет и несколько свертывается или, становится шишкообразной.Цвет колонии от красновато-бурого до коричнево"оранжевого. Спорангии не образу ютсяАгар Анио-Генссена.Отличный рост. В точке инокуляции образуется колония диаметром 0,5 см за д) 4 недели. Отсутствуютвоздушные гифы. Колония имеет круглую, крестообразную или звездообразную форму с понижением или расселиной в центре. Спорангии образуются в большом количестве в колониях, инкубиро-Яованных при 17-19 С, в небольшом количестве в колониях, инкубированных при более высоких температурах.Продуцент антибиотика ЯйдорМпеа хранится в коллекции культур сельскохоэяй,Ю 4ственной научно-исследовательской службы,л,Северное отделение изучения питательныхвеществ, департамента сельского хозяйства,США Пеория, Иллинойс 61604, за номеромАЮеЧ. 5462.Культуральнвя среда, нв которой выращивают культуру А. 1., содержитглюкозу (источник углерода), соевую муку(источник аЬота) и неорганические соли,содержащие ионы натрия, калия, аммония,кальция, фосфат-, хлорид-, сульфат и ацетат-ионы). Для получения лучших результатов в культуральную среду вносят дрожжевые экстракты.рН культуральной среды 6,5-7,3.Для продуцирования антибиотйка в больших количествах используют глубиннуювэробную ферментацию в больших танках.Небольшие количества антибиотика получают в матрицах-каналках. Вегетативныйинокулум получают инокуляцией небольшого:объема культуральной среды спорами илифрагментами мицелия, полученную свежуюактивно растущую культуру микроорганизма(вегетативный инокулум) переносят в большой танк. Среда, используемая для выращивания вегетативного инокулума, можетбыть такой же, как и для выращиванияантибиотика в больших количествах.Продуцент антибиотика можно ве,квщивать при 20-40 С, предпочтительно при30 С,При аэробной глубинной ферментациистерилизованный возцух пропускают илипродувают через культуральную среду, Для,роста микроорганизмов и продуцированияантибиотика подают в танк 0,1 объема возпуха в 1 мин на 1 объем культурвльнойсреды.Максимальное процуцирование антибиотика наблюдается в течение 2-6 цней в большом танке или колбе-качалке.Антибиотик извлекают из культуральной среды и отделяю от других присутствующих веществ методом экстракции или адсорбцееее, В качестве экстрагента используют хлороформ, который хорошо растворяет антибиотик, выделяемый иэ подщелоченной культуральной среды, Для дальнейшей очистки антибиотик хроматографируют, например, на угле, полиамидной смоле, силикагеле, сефадексе Н 20, амберлите Хду П р и м е р ,1. Ферментация антибиотика в колбе-качалке.Приготовленную культуру А.Щ 8).5462 выдерживают на косом агаре следующего состава:517265 5Стерилизованиная сухаяовсяная мука, гСухие пивные дрожжи(беэ горечи), гГидрофосфат калияК НРОМинеральная средаЧапека, млАгар, мл 110 4,0 0,5 ГлюкозаКартофельный крахмалМелассаРастворимый мяснойпелтонКазеин, гидролиэованный ферментативноСоевая мукаСульфат магнияКарбонат кальцияАнтивспенивательВода л 2,5 4,0 1,0 0,4 1,0 0,3 0,2 0,02 До 25 5,01100 Н реды после стерилизации в автокпа 4.15 ве при 120 С в течение 30 мин равен 6,Инокулированнук среду оставляют в ферментере емкостью 40 л на 4 дня при 30Оо(Ферментационную среду аэрируют стерилизованным воздухом иэ расчета 0,5 объема Косой агар инокулируют А. 1, ФОЙЬ 5462 и инкубируют 10-14 дней при 30 С, В указанной среде культура обычно, не образует спор. Поэтому необходимо пленку мицелия промацерировать. плоской заИ остренной инокулируюшей иглой для увели ,чения числа потенциальных центров роста, Мацерированную зрелую культуру покрывают бычьей сывороткой и аккуратно царапают.;0 стерильным стержнем для получения мицелиальной суспензии, которую переносят в ,6 пробирок для лиофилизации, Лиофилиэат из какой-нибудь пробирки используют для инокуляции 50 мл вегетативной среды, со35 держащей (г); ГлюкозаКартофельный крахмалСоевая мукаОбезжиренная мука изсемени хлопчатникаКарбонат кальцияВода, л 10 30 20 20 2 1,1 Инокулированную вегетативную среду в колбе на 250 мл инкубируют 72 час при 30 С на ротационной качалке (250 об/мин). отбирают 10 мл инкубированной вегетатив ной среды и инокулируют 200 млавегетатив,ной среды второй стадии, Среду (второй стадии) в колбе на 1 л инкубируют 24 час ,при 30 С на ротационной качалке (250 об/мин) . П р и м е р 2; Ферментация антибиоти:ка в танке.200 мл. полученной вегетативной среды ,второй стадии (см. пример 1) используют ,для инокулирования 25 л стерильной про дуцентной среды, содержащей (70):ЕоМинеральная среда Чапека состоит из.(раствор в 2 мл кондентрированной соляной кислоты), 100 г хлорида калия КС 1,(: 100 г сульфата магния Мр оО . УН 0и до 1 л обессоленной воды. К среде;(рН 6,2) добавляют едкий натр до рН 7,3и стерилиэуют в, автоклаве 30 мин при, 120 С (рН 6,7),воздуха на 1 объем культуральной среды в 1 мин. Ферментационную среду перемешивают обычной мешалкой (400 об/мин).П р и м е р 3. Выделение антибиотика,Всю ферментационную жидкость (бульон) из танка емкостью 25 л отфильтровывают, добавляют к фильтрату 2 н. едкий натр до рН 8,5, экстрагируют 2/3 объеме хлороформа, упаривают экстракт в вакууме до небольшого объема и медленно при перемешивании приливают к 20 объемам петролейного эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, сушат в вакууме и получают 3,13 гнеочищенного антибиотика,Неочищенный антибиотик растворяют в100 мл этилацетата, пропускают через колонку с основным глиноземом, промываютколонку 300 мл этилацетата, элюируют,примере 3, осаждают антибиотик петролей.ным эфиром, 5 г выделенного продуктарастворяют в 10 мл этилацетата и достаточном количестве метанола, чгобы получить прозрачный раствор, пропускают раствор через колонку с 300 г силикагеля вэтилацетате, промывают колонку 2,5 лэтилацетата до удаления примесей и элюируют антибиотик смесью этилацетат - это,нол (95;5), Активные фракции объединяют,упаривают досуха в вакууме и получают2 гбелого порошкообраэного антибиотика.1 При дальнейшем элюировааиии дополнитель517208 Составитель С щанютинаРеданор 1,П 1 ар аиова Техредт Корректорд, араненко ЛнКотова Заказ 597 Изд. И /3" Торнес ф Подписное 1111 ИИ 1 И Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, 113035, Раушская наб., 4. Способ получения азотсодержащего антибиотика, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что кулътуру Ас 1 аер 1 анеа 1 йррензз ФЙЬ 1 и ф 462 выращивают йа среде, содержащей,оно и выделяют целевой йроЛукт известНыми приемами.