Способ количественного определения антипирина в крови

(22) Заявлено 18.07.80 (21) 29598111/30-15с присоединением заявки Ьеударетвенный комитет СССР нв делам нэобретеннй н открытнй(23) Приоритет Опубликовано 23.02.82, БюллетеньДата опубликования описания 23.02,82(72) Авторы изобретения Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССРи Московский ордена Ленина и ордена Трудового КрасногоЗнамени государственный университет им. МВъДомоносова.(5 ч) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИПИРИНАВ КРОВИ Изобретение относится к аналитической химии и может быт ь испол ь зсвано в медицине, фармакологии и биохимии еАнти пири новый т ест пр едложен для количественного определения влияния различных факторов на способность печени мет аболи зир о вать ле карс т ва.Известен спектрофотометрический способ определения антипирина в крови. Антипирин экстрагирует из крови1 О хлороформом, затем его упаривают и остаток растворяют в разбавленной серной кислотеК раствору прибавляют нитрит натрия, измеряют величину оптической плотности образовавшего 1 ся 11-нитрозоантипирина при 350 нм. Концентрацию антипиринэ определяет по градуировочному графику ( 1Однако для известного метода опБ ределения необходимо от 1 до 5 мл крови на каждый из 6-10 образцов, используемых при проведении фармококинетических исследовачий, При этом 2анализ каждого образца занимает не менее часа. К недостаткам метода следует также отнести использование токсичного хлороформа.Целью изобретения является сокращение объема исследуемого образца и времени определения.Поставленная цель достигается тем, что образцы гемолизированной крови вводят в реакцию окисления дифенилкарбазона перекисью водорода, после чего измеряют оптическую плот" ность пробы с интервалами во времени, а по изменению оптической плотности определяют антипирин в пробе,П р и м е р,А, Построение градуировочного графика.У обследуемого до приема антипи" рина отбирают из пальца в микропробирку с 5 мкл гепарина примерно 0,15 мп кровиКровь подвергают гемолизу, помещая пробу на 30 мин в холодильник (5 оС ). с последующим размораживанием. В четыре микропробиркиТаблиц а Значение оптической плотности в фиксированныемоменты времени, с Заданнаяконц ентр ац ия антипири на(для градуировочного графика,мкг/мл Изменениеопти чес койплот нос имин 10 Среднее зрачеие 1 О20 30 0,850 0,810 0,780 0,75 0,850 0,8000,820 0,765 0,870 0,810 0,870 0,810 0,860 0,790 21,65 Ор 755 22,2 0,690 21,1 0,740 26,1 10 26,2 26,15 0,710 30 0,735 31,9 0,735 31,9 31,90 0,700 50 3 9069 наливают по 30 мкл гемолиэированной крови. Пврвую пробирку используют как ньулевую пробу", во вторую - четвертую пробирки прибавляют по 3 мкл водного раствора антипирина с концентрацией 100 мкг/мл, 300 мкг/мл и 500 мкг/мл антипирина соответственно. Таким образом, получают четыре образца, необходимые для построения градуировочного графика, с кон центрациями антипирина во второй- четвертой пробирках соответственно 10 мкг/мл, 30 мкг/мл и 50 мкг/мл. Эти значения концентраций градуировочного графика находятся в пределах концент з раций антипирина, наблюдаемых в крови обследуемых в течение 21 ч после приема 1 г антипирина.Далее проводят реакцию окисления дифенилкарбаэона перекисью водорода в кварцевом смесителе с 3-мя отростками. В 1-ый отросток смесителя вводят 0,5 мл раствора дифенилкарбаэоиа, во 2-й - 1 мл раствора перекиси водорода, в 3-ий - 10 мкл крови из "нулевого" образца микропипеткой на 10 мкл. Промывают пипетку в тот же отросток смесителя 10 мкл боратного буферного раствора. Затем буфернь 1 м раствором доводят общий объем в смесителе до 10 мл.Смеситель переворачивают, одновременно, включая секундомер. Энергично встряхивают. Через 5-10 с переливают раствор в кювету (длиной 3 см)35 1 фи на пятом светоФильтре (80+10 нм) ФЭКМ измеряют значение оптической плотности через 20,30 и 15 с, после смешения. Каждый раэ после проведения измерений смеситель и кювету многократно проньвают бидистиллированной водой.Аналогично проводят реакцию с участием всех остальных образцов крови (концентрации антипирина 10,30 и 50 мкг/л), Измерение каждой пробы осуществляют дважды.На основании измеренных величин оптической плотности растворов, полученных через 20,30 и 15 с после смешения растворов, строят прямую в координатах оптическая плостностьвремя и определяют изменение оптической плотности л А за единицу времени й или, что то же самое, тангенс угла наклона прямой (1 д). В табл.1 приведены значения 1 с, приведенные к 1 мин- =60 с), квк обычно принято в кинетйческих методах анализа, а также средние значения йр с 1 полученные по результатам двух измерений. Градуировочный график строят, откладывая по оси ординат средние значения йр, а по оси абсцисс,- соответствующие известные концентрации антипирина в крови.В табл.1 приведены данные для определения содержания антипирина в крови.906941 6Продолжение табл.1 0,920 0,8 38,05 37,7 ф 7 Неизвестные концентрациианти пири на,00 0,950 36,75 О, 860 0,8 через 2 О, 740 осле приемрепарата 0,860 , 0,8 0,740 9,10 1В табл.3 приведены результатопределения антипирина кинетиче ким и спектрофотометрическим ме зо ами. В, Определение концентрации антиирина в крови. Обследуемыи принимает 1 г антипирина, Через 1 и 2 ч после приема препарата у него из пальца отбирают кровь в микропробирки по 30 мкл, в которые предварительно введено по 5 мкл гепарина. Пробы до анализа храв нятся в холодильнике (-5 фС,Т.абли ца 2 Введенопероральн 100 мг 1 етод определения антипирин Времяпослеприемаантипи кинетическии найдено, мкгlмл айдено, мкг а,Обследуемый 5+ 22Обследуемый 29+ 1 Аналогично указанному проводят измерения 18 д, для неизвестных концентраций антипирина (табл.1) и по градуировочному графику находят соот ветствующие значения концентраций ан ти пири на.Полученные по градуировочному гра фику величины концентраций антипирина у двух обследуемых приведены в табл.2.Для проверки правильности метода все образцы крови исследовали на содержание антипирина одновременно спектрофотометри ческим методом. спектрофотометрический906941 8Таблица 3 Метод определения антипирина Мет од в вед енияанти пири нав кровь ки нети ческий спе ктр офот омет ри чес ки й найдено,мкг/мл введено, найдено,мкг/мл мкг/мп введено,мкг/мл 40 Как видно иэтабл.2 и 3, обоими методами получены близкие значения 1 концентрации анти пири на.По сравнению со спектрофотомет ричгским методом кинетический метод анализа антипирина имеет ряд преимуществ.В течение суток у обследуемого должно быть отобрано бобразцов 25 крови через определенные промежутки времени, При и с пол ь зова нии с пе ктрофотомет ри чес кого метода необ ходи мо 50 мл крови, что требует отбора крови из вены. Это связано с необходи мостью введения в вену катетера на весь период исследования, что весьма нежелательно. Для кинетического метода достаточно крови, взятой из пальца. Предлагаемый метод значительно сокращает время анализа. При использовании спектрофотометрического метода на анализ одного образц а затрачивается 1 ч, а хи нети ческого - 1 мин. 40Кинетический метод прост и доступен, Для его осуществления требуется только смеситель и ФотоэлектроФормула изобретения Соста витель Л,РубиноваТехред С.Мигунова Корректор Д,ференц Редактор Л.Лукач Заказ 501/28 Тираж 883 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, й" 35, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул . Проектная, 4 Введено в венозную кровь(модельная система) 40 колориметр, тогда как для спектрофотометрического метода необходимадополнительно разнообразная специальная посуда для проведения предварительной экстракции. Способ определения количества антипирина в крови, включающий подготовку образца крови, с последующимизмерением его оптической плотности, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью сокращения объема исследуемого образца и времени определения, обработку образца крови проводят путем гемолиэа с последующимвведением его в реакцию окислениядифенилкарбазона перекисью водорода,после чего измеряют оптическуюплотность пробы с интервалами во времени, а по,изменению оптической плотности определяют антипирин в пробе,Источники информации,принятые во внимание при.экспертизе1, 1 Вю 1 СЬещ 179, Н 1, 25 (1945