Способ определения аденозинтрифосфорной кислоты в крови

Союз СоветсквСоциалнстмчесиииРесиублни Оп ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ТВОМ.в СИДЕТЕЛСТУ(Ю) Дополнительное к эвт. сеид-ау(22)Заявлеио 31.07.78 (21) 2662644/28-13 с нрисоеиинеииев заяви рй(23)ПриоритетОнублииоваио 15.02,82. бюллетень М 6 Дата ояублниоваиия описания 15. 02. 82(51)М. Кл, 6 01 й 33)48 РвударстювЫ 1 иаитвт Иь.р ав лала взабретеввв и открыта(72) Авторы .изобретения П.И.Явербаум и Л,И.Издебская Иркутский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ В КРОВИгде СК -ЕкЕ -0 Изобретение относится к технике определения аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в крови и може быть использовано в биохимических ана" лизах в научно-исследовательских и клинических лабораториях, преимущественно при изучении отдельных звеньев адениловой системы. Наиболее близким решением к изоб 10 ретению является способ определения АТФ в крови путем приготовления беэбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы. Точ 15 ность известного способа 1 О13 .Недостатком известного способа является его сложность, так как методика определения АТФ основана на многостадийности приемов и на многократном измерении оптических плотностей. Кроме того, для определения АТФ требуются дорогостоящие реактивы и оборудование. Цель изобретения - упрощение снособа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения АТФ в крови путем приготовьления безбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы, в реакционной смеси определяют глюкозу ,глюкозооксидазным методом после добавления гексокиназы и без ее добавления, полученные образцы колориыетрируют со стандартным раствором глюкозы, а АТФ определяют по формулел концентрация АТФ, мг.Е;коэффициент пересчета АТФ; эКстинкция контрольной пробы экстинкция пробы лосле добавления гексокиназы;5 905787 6Средняя ошибка среднего арифмети- за счет различного уровня обмена вческого +7,4 мг %. эритроцитах на момент декатизацниСреднеквадратическое отклонение крыс.+26,5 мг %. Результаты определения содержанияКоэффициент вариации 36,5%. 5 АТФ в эритроцитах у крыс, отравленОтмеченную вариабельность следу- ных свинцом, в различные периодыет отнести за счет индивидуальных после окончания затравки приведеныособенностей животного, в частности в таблице,13 13 13 13 115,5 103,6 88,9 5,9 7,5 6,3 9,8 36,6 22,6 23,2 21,3 Ф г П р и м е ч а н и е. и - число наблюдений;И - среднее арифметическое; щ - средняя ошибка среднего арифметического; г - среднеквадратическое отклонение.гексокиназаТаким образом, концентрация АТФ зная реакция: глюкоза + АТФв эритроцитах крыс контрольной групИд +фглюкозо-фосфат + АТФ, в результапы составляет 77 мг %. В последние З 0те которой расходуется глюкоза, сосроки развития свинцовой интоксикадержащаяся в эритроцнтах. В контроль-,ции уровень АТФ в эритроцитах белыхной пробирке уровень глюкозы не измекрыс повышается.няется, так как в реагирующей систеП р и м е рСвежевзятую кровьме отсутствует гексокиназа.лабораторного животного (крысы) 354-8 мл помещают в охлажденную до Используемый ТЭА-буфер (О 05 мэ20 С и смоченную гепарином пробиркУ, РН 7,5-7,6) готовят следующим обраДля выделения эритроцитов пробу кро- зом. 4,65 г гидрохлорида триэтанолви центрифугируют 10 мин при амина растворяют в 200 мл дистилли 2500 об/мин. Отделившуюся в резуль рованной воды и добавляют 11 мл 1 н.тате центрифугирования плазму отса- раствора КаОН, затем полученный раст"сывзют. Для осаждения белков эритро- вор доводят дистиллированной водойциты смешивают с предварительно ох- до 500 мллажденным 15%-ным раствором ТХУ в После термостатирования рпреде-соотношении 1:1 (1,5 мл эритроцитов .45ляют содержание глюкозы в контрольи 1,5 мл ТХУ), и пробирку помещаютной и опытной пробирках глюкозооксина 10 мин в ледяную баню, после чего азным спос б м ядазным способом. Для этого из контвторично центрифугируют 1 О мин при рольной и опытной п б к брольно и опытной пробирок берут2500 об/мин, Полученный безбелковый по 0 3жмл содержащегося в них растЦентрифугат собиРают в чистУю про во а и пвора и приливают в пробирки, в которые предварительно внесено поДля проведения гексокиназной ре мл дистиллированной воды иакции в две пробирки (контроль и 3,0 мл.дианизидинового реактива. За опыт) приливают реактивы, Затем тем проверяют РН и при необходимостиобе пробирки помещают в термостат55доводят до 5,9, и приливают в обеВпри 37 С на 20 мин. В результате до- пробирки по 0,1 мл 0,1%-ного растбавления раствора гексокиназы в опыт- вора глюкдзооксидазы и 0,1%-ногоиой пробирке протекает гексокина- раствора пероксидазы, Одновременно905787 готовят стандартный раствор, содержащий 4,7 мл дистиллированной воды,0,03 мл стандартного раствора глюкозы (100 мг %), 3 мл дианизидинового реактива, О,1 мл 0,1%-ного ра- зствора глюкозооксидаэы и О, 1 мл0,1%-ного раствора пероксидазы.Используемый при этом дианизидиновый реактив готовят в день проведения анализа, 50 мл 0,4 М калий - 16фосфатного буФера при рН 5,9 приливают 1 мл 1 Ж-ного спиртового раствора О-днанизидина и доводят дистиллированной водой до 100 мл.Все три пробирки (контроль, опыт,стандарт) помещают в термостат при45 С на 30 мин. В этих условияхОпротекают следующие реакции:глюкозооксидазаглюкоза + О глюконолактои + Н Оу1 с 1пероксидазт н О 9.окисленный дианизидин + НО.Окисленная форма дианизидина имеет выраженную окраску,В 23Через 30 мин термостатированиявсе пробирки извлекают и в каждуюприливают по 2 мл 50%-ной сернойкислоты. В результате добавления серной кислоты образовавшаяся оранжево-желтая окраска переходят в розое 4 втиземетоБражниковаь Корректор А.Дзят остави тель ехред М. Н Редактор Л,Тираж 882 ВНИИПИ Государственного комитет по делам изобретений и открыт 113035, Москва, Ж, Раушскаяаэ 357 б ПодписноеСССР аб д л. Проектная, 4 После охлаждения пробирок с содержщмм до комнатной температуры (21-23 С) растворы колориметрируют на фотозлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 530 нм) в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм против раствора, содержащего б мп дистиллированной воды, 3 мл дианиэидинового реактива и 2 мл 50%-ной серной кислоты.Используя значение коэффицйеита пересчета АТФ мг Х 676,0 и измеренных величин экстинкций Е 1(экстинк ция контрольной пробы) 0,028, Е 0 (экстинкщюя опытной пробы) 0,016 и Е (экстиикция стандартного растал 1 П 1 П Патент, г. Ужгор 8вора) О,О, вычисляют концентрацию АТФ по ФормулеС "(к- о) аЬ,ох(О,ОМ-О,ОЬ)=921 П% А 1 ФТочность количественного определения АТФ по предлагаемому способу соответствует точности известного способа.Предлагаемый способ проще известного и исключает многоэтапный анализ при количественном определении АТФ в эритроцитах.Кроме того, при использовании предлагаемого способа снижается стоимость одного анализа за счет исключения дорогостоящего оборудования и реактивов более чем в 1000 раз.Формула изобретенияСпособ определения аденозинтри" Фосфорной кислоты (АТФ 7 в крови путем приготовления безбелкового центрифугата пробы с последующим добавлением в реакционную смесь гексокиназы, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью упрощения способа, в реакционной смеси определяют глюкозу глюкозооксидазным методом после добавления гексокина". зы и без ее добавления, полученные образцы колориметрируют со стандартным раствором глюкозы, а АТФ,: определяют по формулеКЯ,Я )- зкстинкция пробы послебавления гексокиназы",С- экстинкция стаидартногствора.Источники инФормации,е во внимание при эксперсатиани В.С, Ферментныеза. М., "Наука", 1969,2-266.