Способ количественного определения доступного лизина в белках

Союз Советск и иСоциалистическихРеспублик ВТОР СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ23) Приоритет Опубликовано 30.11.8 алаи изабретеи етень М 4) Удф 543.0621й 543.43 (088.8) и открытии Дата опубликования описания 30,2) Авторизобретен 1 А.Ф.Сысое нД:лововрффЩХН 1 ЙЗЫ.1 ИфщЩвго .1 Ц".1 ЦЯ Ленина и ордена Тнно-генетический и орделекци сесоюзн Знамени 71) Заяви лед тт 1 11.А 54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОСТУПНОГО ЛИЗИНА В БЕЛКАХ особам ив носится угих бе ого и ж содержа емого о б колич обретение о и зерна и д в раститель хождения по пного ( усво а.вестен спос ковых провотного нию в них ганизмом ) н дук прои дост лизи ественного лизина в белзмельчение 3 нее белков ором 2,4-дия доступног ающий тонко атурирование иу белков раствензола. 11.этот способ недостаточнокольку помиь 1 о-аминогрупвступали во.взаимодействием фенольные, имидозольные,ые и сульгидрильные остатс лагаем белков ы лизина реактив белков,важностла с течерез си20необходиосущест и аминокислот. Цель изобретения -есса и повышение точиощение прои определеПоставленная цель д что для денатурации б водный раствор этанол ем, уют тигае ов исполОЕ-ной ке вст н.определениках, вклюпробы, деи обработнитрофторОднакоточен, по центрации, в качестве реакт а дляобработки белков используют растворД-бензохинона, а после обработкибелков реактивом анализируемую пробу обрабатывают при 70-71 ф С раствором-аминокапроновой кислоты споследующим охлаждением,центриугированием и колориметрированием. Причем используют 0,02 Х-ный растворП-бензохинона в 88-953-ном этаиоле, 1 Оф а также 17-ный раствор-аминокапроновой кислоты в 703-ном этаноле. льку доступный лизин по преду способу определяется впродуктах без гидролизаследует особо подчеркнутьтонкого измельчения материа.чтобы 807 муки проходилото 0,1 мм. При отсутствиимых мельниц тонкий помолляют измельчением материалас равным по весу порошком8858В экспериментах использовался ЬХФирмы Реахим (чистый). Реакционнаяактивность определялась иодометричес-ким способом, Она оказалась равной88 9%. При более низкой активностиреактив следует перекристаллизоватьиз спирта,Концентрация спиртового ( этанолраствора БХ подбиралась экспериментально.на основе развиваемой окраскипосле добавления лизина илиаминокапроновой кислоты. Наиболее оптимальной оказалась концентрация БХ,равная 0,02%. В 4 мл такого растворасодержится с учетом чистоты5712 мгк БХ,Учитывая, что на однуМолекулу лизина расходуется две молекулы БХ, это соответствует 480 мкглизина. Теоретически при навескебелкового продукта, равной 50 мг,этого количества БХ достаточно, чтобы20определить доступный лизин при егосодержании 0,8% и вьппе на сухое вещество, Фактически этот предел недолжен превьппать 0,5-0,6%, так какв разбавленных растворах БХ его реак 25ции с лизином замедляются, При определении лизина в продуктах с болеевысоким его содержанием ( сухое молоко, зерно-бобовые культуры, мясокостная мука и др.) концентрациюлизина в исходном материале следуетпонизить путем смешивания в ступкес соответствующим количеством чисто.го крахмала. Напротив, при болеенизких содержаниях общего лизина 35( 0,2-0,3% ) навеску материала можноувеличить до 100 мг.Раствор БХ в зтаноле при хранении в комнатной температуре, даже в ко-.ричневых склянках, постепенно желтеет. В целях предотвращения этого процесса в раствор следует добавить следовые количества азотнокислой ( окисной) ртути, К 10 каплям насьпценного раствора Нс (МО)(400-450 мг) добавляют 10 капель койцентрированной азотной кислоты и доводят. водой до 100 мл.К 100 мл 0,02%-ного БХ в 88%-номэтаноле добавляют О,З мл рабочего раствора Н (140) . При хранении в холодильнике раствор БХ не теряет годности в течение 2 сут.В целях использования в анализах регенерированного эталона в работе применялся 88%-ный этанол.(отгонка с 80 см деФлегматором. Этанол-ректиФикат можно заменить гидролизным этанолом высокой очистки, Концентрация 744спирта ниже 75% повышает чувствительность реактива к другим аминокислотам.В качестве контроля можно применятькак раствор основного лизина, так ираствор Я -аминокапроновой кислотыв 70%-ном спирте. Однако наличиеу свободного лизина второй ЙН -груп 2пы усиливает его нуклеофильность,вследствие чего реакция взаимодействия с БХ ускоряется и при большихконцентрациях лизина и. 70 фС заканчивается через 10-15 мин, в то времякак для завершения реакции БХ с1 "аминокапроновой кислотой при техже условиях требуется 20-30 мин, Поскольку остаток молекулы лизина,связанного в белках, по количеству СНи ЙН-групп соответствует ЕАК кислоте, йоследняя является более предпочтительным реактивом в качестве контроля и стандарта для калибровочнойкривой,Недостатком Фирменного препаратаЕАК кислоты является присутствие,некоторого количества лактамной 1 циклической) Формы, которая не взаимодействует с БХ, Поэтому расчет концентрации раствора ЕАК кислоты длякалибровочной кривой производился нена основе стехиометрического соотношения, а путем подгонки оптической плотности раствора ЕАК кислоты к оптической плотности раствора лизина.Изучение реакции БХ со свободными аминокислотами показало,что из общего числа нейтральных и кислых аминокислот только глицин и пролин развивают слабую окраску с раствором БХО,ОЗ,04 экстинкции при концентрации 1 мм) однако содержание этих аминокислот в свободном .виде в измельченном зерне весьма незначительно, а глицин и пролин, связанные в белках, не всту-, пают в реакцию с БХ. Что касается аргинина и гистидина, то их присутствие в анализируемом материале несколько повышает экстинкцию и составляет до 1/3 суммыэкстинкции свободных лизин-аргинин-гистидин.Однако есть основания считать, что будучи связанным . в белках, ойи также не реагируют с БХ, что подтверждается отсутствием их взаимодействия при анализе зерна кукурузы. Эти же данные указывают на огсутствие реакции БХ с концевыми аминогруппами белков.Экстинкция контРольных пробирок 1,39. Количество БХ в единипах экстинкции, связавшегося с лизином белка, составляет: 1,39"0,79 щ 0,60.По калибровочной кривой это соответствует 196 мкг лизина в 50 мг зерна и 392 мкг в 100 мг зерна,а на сухое вещество 1,при 10% влажности) 421 мкг или 0,421%.На аминокислотном анализаторе в этом образце определено 0,52% общего лизина на сухое вещество, Следова" тельно доступный лизин составляет 0,421 х 100 0,52 Предлагаемый способ определеююядоступного лизина прост, не требует дорогостоящих реактивов и может иайти широкое применения.для оценки пищевых и кормовых достоинств белоксодержащих материалов. Формула изобретения 1. Способ количественного опреде-. ления доступного лизина в белках,включающий тонкое измельчение пробы, денатурирование из нее белков и обработку белков реактивом,о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения точности определения, для денатурирования белков используют водный раствор этанола, в качестве реактива для обработки белков используют раствор П -бензохинона, а после обработки белков реактивом анализируемуюо пробу обрабатывают при 70-71 С раствором .-аминокапроновой кислоты с последующим охлаждением, центрифуги" рованием и колориметрированием.2, Способ но п,1, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что используют 70%-ный водный раствор. этанола.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю щ и й с я тем, что используют0,02%-ный раствор П -бензохинона в88-95%-ном этаноле.4. Способ по пп.1-3,о т л и ч аю щ и й с я тем, что используют1%-ный раствор 6-аминокапроновой .кислоты в 70%-ном этаноле.Источники информацнрпринятые во внимание при экспертизе1. Луппа Х. Основы гистохимии,М.,1980, с. 68-69,Тираж 910 Подписное 5 885874еСпособ осуществляется следукнцимобразом.Из каждого тонкоизмельченногообразца берут по три параллельныхнавески по 50 мг и переносят в сухиепробирки, добавляют по 0,5 мп 70%-ного эталона, спегка перемешивают, закрывают резиновыми пробками, обернутыми апюминиевой фольгой, и помещаютв водяную баню на 15 мин при 70-71 С. 1 ОЗатем в каждую пробирку добавляютточно 4 мл 0,02%-ного раствора 11 -бензохинона в 88%-ном эталоне (с 0,3мл рабочего. раствора Н (ЙОЗ) на100 мл БХ. В две контрольные про- эи 8 бирки добавляют 0,5 мл 70%-ного спирта и такое же количество БХ. Послеосторожного перемешивания все пробирки закрывают пробками и переносят вбаню на ЗО мин при 70-7 о С. Через укаждые 1 О мин кассету с пробиркамислегка встряхивают. После окончаниянагревания пробирки охлаждают,пробирки первой параллели оставляют вштативе,а к содержимому двух оставшихся параллелей добавляют по 0,2 млраствора 6 -аминокапроновой кислоты(100 мг в 10 мл 70%-ного этанола).Раствор перемешивают, пробирки закрывают пробками и нагревают на водяной бане при 70-71 С в течение. 20 мин, Затем содержимое пробирокохлаждают, центрифугируют 5 мин при6000 об/мин.(полиэтиленовые пробирки)и не позжеч после нагревания коФВщ Э лориметрируют при 500 нм.По разности между оптической плотностью контрольного и опытных растворов с помощью калибровочной кривой.определяют содержание лизина.П р и м е р . Образец - высоколизиновая кукуруза (навески измельченного зерна по 50 мг). После нагревания с 0,02%-ной БХ экстинкцияраствора иа фотоколориметре "Спекол". 4 Всоставила 0,06. Доля окраски эа счетсвободного лизина (принятая 2/3 от общей окраски равнялась 0,04.После йагревания с 0,2 мл 1,0%-ного раствора-аьынокапроновой кислоты экстинкция раствора была в 1500,825, во П О,835; среднее - 0,83.Поскольку окраска раствора послепервого нагревания суммируется сокраской после второго нагревания,ее следует вычесть: 0,83-0,04 = 0.79ффВНИИПИ Заказ 10533/64