Способ получения -галактозидазы

(32) 06.02,78 Госуаврстееекык комитет СССР 33)82. Ью и кэобретеноткрытий убликовано 15 тень ЛЧЬ 30 3) УДК 577.15(088,8) вв ае та опубликования описания 18,08 Авторызобретен Иностр н Нива, Рейсуке Концьая Киеси Такит я фирмари К.О.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 5-450 и рН 120 ч с пов аэр среды следу культу раство фильтр статочно ляетс жен х ой Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения э-галактоэидазы, предусматривающему культивирование продуцирующего его микроорганизма штамма иэ рода Реп 1 с 1111 цщ на питательной среде, содержащей ассимилируемый углерод и источники азота совместно или без минеральных солей, в аэробных условиях с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, в качестве продуцируюИностранИзобретение относится к микробио ической промышленности, в частностспособам получения фермента -гаактозидазы. Известен способ получения 1 э-галактозидазы путем культивирования штамма,- продуцента Аьрего 111 цз огулае ГЕКИ"Гна питательной среде, содержащей отруби в качестве источника азота и другие питательные компоненты с последующим выделением и очисткой фермента. Полученный препарат гидролиэует лактоэу, 0-цп-нитрофенилР-галактопираноэид и фенил-э-Р-галактопиранозид Е 1.Активность фермента невысока,Наиболее близким к предлагаемому является способ получения о-галактоэидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего его микроорганизма штамма родэ Репс 111 цщ на питательной среде, содержащей ассими:лируемый углерод и источники азота совместно или без минеральных солей обных условиях при3,5-8 в течение 16 ющим выделением фермента иэ ральной жидкости экстракцией рителем, осаждением, очисткой, ацией и т,д, 1,2 Д.ученный фермент обладает до высокой активностью, но не явтермически стабильным и доланиться на холоду.ь изобретения - повышение ст и активности целевого продук 952111 420 щего микроорганизма использую. штаммРепс 11 цщ шц 1 Ссо 1 ог КО-312,идентифицированный как ГЕЙМ или АТСС 20539, а в качестве источника азота - отруби.5Сущность способа состоит в том,что для получения фермента 11-галактоэидаэы используют штамм Репс 11 цввц 1 йсо 1 ог КО-312.Этот штамм депонирован в японском депозаторном институте по исследованию ферментации Агентства индустриальной науки и технологии ЯпонииКиаго Тиба Сити 25 января под номером ГЕКИ-Р 4375 а также в, Американской 1 БКоллекции типовых культур под номером АТСС 20539.Морфологические, свойства, присущиештамму Репс 11 шп вц 1 Ссо 1 огКО-312,Макроскопические наблюдения (после инкубации при 25"С в течение10 дней на агаровой среде Чапека).При росте Репс 11 ап щц 1 йсо 1 огобразуются колонии диаметром 30 - 2540 мм. Поверхность радиально морщинистая с плотным бархатистым слоемконидиумов от глубоко сине-зеленогодо серовато-зеленого цвета, периферия на ширину 1-2 мм от оранжевого з 0до желтого цвета. Обратная сторонаот желтого до коричневого цвета.Микроскопические наблюдения (после инкубации при 25 С в течение10 дней на агаровой среде Чапека).Пучки мономутовочные.Конидофоры прямые и вертикальные,без разветвления, шириной 2-3 мк срасширением к концу,Стеригма; от 6 до 14 стеригм впачке.Конидиум сферический или овальнойФормы диаметром 2-3 мк.Поверхность гладкая.- При использовании предлагаемогоспособа штамм Репс 111 ца вц 1 йсо 1 огможет культивироваться в жидкой илив твердой питательной среде при при"менении известных методов в анаэробных условиях, Культурапьная средасодержит одно ипи более природноепитательное вещество, а именно пшеничные отруби, рисовые отруби, обезжиренную соевую муку муку хлопковых, семян в качестве основных компонен) 5тов, Купьтуральная среда может такжесодержать лактозу, крахмал, глюкозу,арабинозу и ксилозу в качестве источник у) перода и сульфат аммония нит" рат натрия, пептон, солодовый и дрожжевой экстракт в качестве источника азота. В культуральную среду могут быть включены неорганические соли, например фосфаты и соли магния и кальция. Обычно целесообразно проводить культивацию Репс 11 цв па 1 -осо 1 ог при 10-35 С, предпочтительнее 25-33 С, в среде с рН 4-9, предпочтительнее 5 7, в течение 1-8 дней, хотя условия культивации могут изменяться в зависимости от способа культивации . Продуцирование новой /3 - галактоэидазы согласно предлагаемому способу достигает максимума после 2-6 дней инкубации.При культивировании в твердой среде новая )-галактоэидаэа может получаться с активностью около 1000 едиединиц на 1 г твердой культуральной средыПри культивировании в жидкой среде можно получить фермент с активностью около 150 единиц на 1 мл жидкой среды.Для извлечения-галактозидазы согласно изобретению из культуральной среды Репс 11 цщ щц 1 ссоог) где образуется и накапливается фермент, жидкую культуральную среду освобождают от твердых веществ фильтрацией или центрифугированием и полученный фильтрат затем концентрируют отгонкой под уменьшенным давлением или пропускают через диалитическую мембрану и затем подвергают процессу высаливания сульфатом аммония или процессу осаждения ацетоном и/или этанолом для получения неочищенного порошка /5-галактозидаэы. Твердую культуральную среду обрабатывают водой (для экстракции фермента) и полученный водный экстракт обрабатывают таким же образом как упомянутый фильтрат., Сама культуральная среда, фильтрат и водный экстракт могут использоваться в качестве неочищенной -галактозидазы. Для дальнейшей очистки неочищенная (-галактозидаза может быть обработана по известному методу очистки энзимов, например методом ионообмена, гелевой фильтрации, диализа, адсорбции и методом осаждения протеина. Когда концентрированный фильтрат или водный экстракт, содержащий-галактозидазу смешивают с ацетоном до содержания его 30-40 вес.3 почти вся -гапактозидаза может быть осаждена в виде порошка, который после сушки обнару95211 100 100 224 393 288 186 Около100000 Около120000 3,5-8 257 55 50 Менее60 Менее75 3,5-8,0 2,5-8,0 50 10060 живает, например, высокую галактозидазную активность порядка 34,8 ед ./мг . Порошковая Р-гапактозидаза активностью 34,8 ед/мг обычно не требует дальнейшей очистки, если назначается орально не переносящим лактозы пациентам в виде порошка, гранул или таблеток в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, например крахмалом, может быть растворена в моло О ке и любом напитке, принимаемом пациентом.Активность - галактозидазы оценивают по обычному методу испытания следующим образом. 15Смешивают 1 мл субстратного раствора, содержащего 3,7 мг/мл о-нитрофенил- - О-галактопиранозида в воде, 2 мл 0,2 М забуференного раствора макильвана (рН 1,5) и, 1 мл раствора 20 энзима, смесь нагревают при 37 Со 15 мин для вызывания энзиматицеской реакции. После этого реакционную Субстрат (гликозиды) Лактозао-НитрифенилО-галактониранозид и-НитрофенипО-галактониранозидМолекулярный вес(по гелевому методу)Оптимум рН Активное рН (пределы, в которыхактивен энзим) Оптимум температуры, о С Активная температура (пределы темо пературы, в которых активен энзим) С Стабильность при рН (предел рН, в котором энзим стабилен при стоянии в течение 24 ч при 4 С) Термическая стабильность (остаточная1 у.галактозидазная активность послестояния 15 мин при рН 6), Ф притемпературе, Со 1 6смесь смешивают с 1 мл водного 1 Мраствора карбоната натрия для остановки реакции . Для определения содержания образовавшегося о-нитрофенилареакционную смесь подвергают колориметрицескому анализу при длине волны 420 мкм, используя эталонную кривую для колориметрического анализао-нитрофенола. Когда энзим может давать 1 мкмоль о-нитрофенола в 1 мин,сцйтается что этот энзим имеет1 единицу активности. Для подтверждения преимуществ энэиматицеских свойств-галактозидазы, полученной согласно предлагаемому способу, их сравнивают со свойствами известной (3 - галактозидазы из Реп 1 с 1111 цп 1 с 1 г 1 пцп 1 которая является представительной дпя 3-галактозидазы продуцируемых другими видами Реп 1 с 11111 цп 1 2 . РезуЛьтаты этого сравнения представлены в таблице.,Относительная активность, Ф8Продолжение таблицы 952111 60 70 25 0 Почти не ингибитируется Железо (Ге)Медь (Сц )Ртуть (Н 9 ) Почти не ин- гибитируется Почти не ингибитируется Почти не ин- гибитируется Почти не ингибитируется Ингибитируется на 20 6,41 8771 82 64 вес.3 метанолавес.3 этанола содержащая 50 содержащая 40 Вода,Вода,91 Вода, содержащая 40 Вода, содержащая 50 вес.4 ацетона Ф вес.4 ацетонаЭффект металлических ионов при молярной концентрации 10 Изо-электрическая точка, определенная электрофорезом Растворимость в водных органическихрастворителях,Вода, содержащая 40 вес.Ф метанола Вода, содержащая 50 вес.Ф этанола П р и м е р 1. Твердую культу 35 ральную среду, состоящую из 10 г пшеничных отрубей, 10 г обезжиренной соевой муки и 20 мл воды., загружают в 500 мл коническую колбу и сте-о 40 рилизуют при 120 С 15 мин в автоклаве и затем заражают косой культурой Реп 1 с 1111 оа ао 1 С 1 со 1 ог КО-132. Зараженную среду затем инкубируют в стерильном воздухе при 28 С 4 дня45 и затем смешивают с 200 мл водного экстракта -галактозидазы в водной фазе. Смесь отфильтровывают для удаления твердых веществПолученный фильтрат, т.е. водный экстракт, об 50 наруживает Ъ-галактозидазную активность в 228 ед./мл.П р и м е р 2. Жидкую культуральную среду (100 мл), содержащую 33 рисовых отрубей, 14 муки хлопковых семян, 0,253 кислого фосфата калия и 0,15 фосфата калия (рН 6,2) загружают в 500 мл колбу и стерилизуют нагреванием в автоклаве. Стерилизованную среду заражают косой культурой Реп 1 с 1111 оа ац 1 й 1 со 1 ог КО- 132 и культивируют с взбалтыванием прио28 С 3 дня на взбалтывающем столе. Инкубированную среду отфильтровывают, Полученный фильтрат обнаруживает 15-галактозидазную активность в 140 ед/мл.П р и м е р За. Твердую культуральную среду, состоящую из равномерной смеси 1,5 кг обезжиренной соевой муки, 1,5 кг муки хлопковых семян и 3 л воды, помещают в виде слоя в большой бак и стерилизуют нагреванием в автоклаве.Стерилизованную среду заражают 150 г посевной культуры Реп 1 с 1111 ца ац 1 С 1 со 1 ог КО-132, полученной инкубированием косой культуры этого микроорганизма в среде из отрубей (смесь пшеничных отрубей и воды в соотношении 1:1 по весу). Затем зараженную среду спокойно инкубируют при 28 С 5 дней и инкубированную сре952111 10 10 формула изобретения Составитель И Техред М.Рейв Редактор Л, Алексеенко Заказ 5991/81 Тирам 505 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР пб делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,9ду размельчают и набивают в цилиндрическую стеклянную колонку, через которую пропускают воду с верха колонки, Раствор экстракта (18 л), содержащий желаемый энзим, получают 5 как элюент внизу колонки, его центрифугируют для освобождения от малого количества твердых веществ, суспендированных в этом растворе, Полученный верхний слой раствора обнаруживает- галактозидазную активность в 347 ед./мл.П р и м е р 3 в, Верхний слой раствора концентрируют до объема 4 л путем ультрафильтрования и затем к 15 нему добавляют по каплям 2,7 л ацетона при низкой температуре. Образовавшийся осадок удаляют фильтрованием, высушивают над уменьшенным давлением и получают 165 г порошка -га в лактозидазы, обнаруживающей высокую 3-галактозидазную активность в .34800 ед./г. Выход 923.П р и м е р 3 с. Порошок -галактозидазы (мощность 34800 ед./г), по лученный описанным путем, очищают да- лее следующим образом.Порошок растворяют в забуференном 0,01 И растворе ацетата при рН 4,5 и полученный раствор пропускают через З 0 колонку с СМ-целлюлозой для адсорбирования фермента. Затем колонку элюируют водными растворами хлористого натрия. Активные фракции элюата объединяют,диализуют с забуференным 0,01 И раствором фосфата при рН 7,0 и диализованный раствор фермента пропускают через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой для адсорбции фермента. Эту колонку элюируют водными растворами хлористого натрия. Активные фракции элюата объединяют и пропускают че" рез колонку с гелевым фильтрационным агентом ("Сефадекс" фирмы фармация К , Швеция), Элюент, выходящий , 45 из колонки, собирают по Фракциям и фракции, обнаруживающие галактозидазную активность на постоянном уровне, объединяют и концентрируют под уменьшенным давлением. К полученному концентрированному раствору добавляют по каплям этанол при низкой температуре для осаждения желаемого фермента. Фермент отфильтровывают, высушивают под уменьшенным давлением и получают чистый порошок р-галактозидазы, обнаруживающий -галактозидазную активность в 170000 ед./г. Выход 504Таким образом, ферментный препарат, полученный предлагаемым способом)обладает высокой активностью и термической стабильностью с остаточной активностью при 60 С (1003), что позволяет хранить его при комнатной температуре в закрытой емкости при 4 С в течение 1 месяца.Остаточная активность сохраняется на уровне 954 и более и при хранении при 45 С в течение 1 месяца на откры- . том воздухе при относительной влажности 50-704. Способ получения/5 -галактозидазы,предусматривающий культивированиепродуцирующего его микроорганизмаштамма рода Реп 1 с 1111 цщ на питатель"ной среде, содержащей ассимилируемыйуглерод и источники азота совместноили без минеральных солей, в аэробных условиях с последующим выделением фермента из культуральной жид".кости, о т л и ч а ю щ и й с я тем,цто, с целью повышения стойкости иактивности целевого продукта, в ка"честве продуцирующего микроорганИзмаиспользуют штамм Реп 1 с 111 цв щц 1 Осо 1 ог К 0-0-312, идентифицированныйкак ГЕКИ-Р 4375 или АТСС 20539, а вкачестве источника азота - отруби.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Заявка Японии М 52-27035кл. С 12 О 13/10, опублик. 1977.2. Заявка Японии И,50-66589,кл. С 12 О 13/1 О, опублик, 1976