Способ получения антибиотика

й Й Сфвз Сааетсннх Соцналнетнчесинх Реенублни(3 ) Р 461635 (33) США С 12 Э 9/00 Государственный комитет СССР йо делан изобретений и открытий(72) Авторы Давид Гленн Мартин и Ладислав Джеймэ Ханкаизобретения (США) Иностранная фирмаТЭ Апджон Компани (США)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА Изобретение относится к областимедицины, в частности к производст ву антибиотиков.Способ получения антибиотика Ц -43,795, в патентной и специальной литературе не описан.Предложен способ получения нового антибиотика 0-43,795, общей формулы Н1 О4 Фсн сн ссЬ ннзаключающийся в том, что культуру ВСер 1 овЧсеэ звсеоэ ИВРе 5439 выращивают в водной питательной среде,со держащей источники углерода, азота или белковый материал с последующим выделением целевого продукта известными приемами.К углеродным источникам относят- ф(1 ся глюкоза, коричневый сахар, сахароза, глицерин, крахмал, кукурузный крахмал,лактоэа,декстрин,меласса;к источникам азота - жидкость после замочки кукурузы,дрожжи,автолизован" ные пивоваренные дрожжи с твердыми веществами молока, соевая, хлопковая и кукурузная мука, твердые вещества молока, продукт переваривания казвина поджелудочной железой, барда,животные пептонные жидкостимясныеи костяные отбросы. Преимущественно применяют сочетания этих углеродных и азотных источников,.Для инокуляции применяют вегетативную форму микроорганизма, ане егоспоры,Вегетативный прививочный материалполучают путем инокуляции почвеннойкультуры 5(г. о 1 аосеоз МВЮ 5439 в пи"тательном бульоне и пересева на скощенную среду, Молодой прививочныйвегетативный материал в асептических условиях переносят в ферментер.Процесс ферментации проводят при20-32 С, рН среды 5,5-7,0, оптимальное образование антибиотика наблюдается в течение 2-10 дней.Для выделения и очистки О "43,795может быть прйменен ряд различныхметодов, например абсорбция с последующим злюированием растворителем, хроматография на колонке, час"тичная хроматография кристаллиэация с выделением из растворителя,Антибиотик 0-43,795 выделяют изкультуральной среды фильтрацией через диатомит (ГВ 40) .Прозрачную питательную средуФильтруют через хроматографическую45 50 0 0 Зоны .нет То же 23 Сильная 29,О -43,795 колонку, наполненную смолой сульфокислоты стиролового типа, Колонку .промывают, антибиотик элюируют основанием. Элюаты антибиотическогодействия смешивают и концентрируют.Полученный водный концентратфильтруют при нейтральном рн через,"колонку содержащую слабо основнуюПопиаьщновую смолу стиролового типаКолонку промывают деиониэированнойводой, 50-ным водным метанолом, эатем элюируют уксусной кислотой в9-ном метаноле Активные фракцииэлюата смешивают, затем упариваютдосуха под пониженным давлением,Полученный остаток хроматографируют на силик(геле 60 в системеметилэтилкетон-ацетон-вода"Получают относительно чистый препарат антибиотика 0-43,795.В процессе выделения антибиотикапроводят биоанализы с использованиемйосжоэ эаЬО 1)зП р и м е р. Ферментация,Почвенный штамм бактерий 5(гер 1 оесеээМееоъ МЮЙЙ 5439 инокулируют вколбах Эрленмейера (емкостью 500 мп)со 100 мп.стерильной среды содержащей 25 г/л декстроэы, 25 г/лРЬагюащед)а и до 1 л водопроводнойводы; РН среды до стерилизации 7,2.прививочный материал выращивают напротяжении 2 дней при 28 С на вращающейся виброустановке при 250 об/мин,Полученным прививочным материаломинокулнруют в колбах Эрленмейераемкостью 500 мп 100 мл стерильнойферментационной среды следующегосостава, г/л:МН,СЕ 5углерод 2Крахмал кУкУРУзный 10.Промытые дрожжи 2,5Кау 5 оу . 20-Ферментационная среда также содержит 1 мп олеомаргарина из свинного сала и до 1 л водопроводной воды;РН среды, перед стерилизацией доводят до 7,2 4 Н гидроокисью натрия.Ферментационные колбы инокулируют в соотношении 5 кп прививочно го материала на 100 мл ферментационной среды. Затем выращивают 2-3дня при 32 ОС на вращающейся виброустановке при 250 об/мин,Выделение. 250 л ферментационнойсреды фильтруют через диатомит средней пористости. Полученную прозрачную питательную среду пропускают через хроматографическую колонку, содержащую 25 л свежерегенерированного Ооьех 50 х 16 (Н+), при рН 7-8.Колонку проьивают 50 л деиониэированной воды, элюируют 120 л 1 НИНОН, собирают 6 л фракционногоматериала. Активные фракции смешивают н концентрируют под пониженнымдавлением для Удаления избыткиНН,ОН,Очистка, Колонка со слабо основной полиаминовой смолой стироловогоатипа,20 Активный водный концентрированный элюат Ооее 50, полученный опи-санным способом, РН 7-7,5 пропускают через колонку, содержащую 4 лАвбвгИе .И 45 (ОН ) . Затем колонкупРомывают 8 л деиониэированной во. ды, 4 л 50-ного водного метанолаи 8 л 90-ного водного метанола.Собирают 2 л фракционного продукта,Наиболее активные фракции, определенные тестом бсасеИаэ эцЫ 1 бэ, смешивают и упаривают досуха подпони. женным давлением.Хроматография, При проведенииэтого процесса применяют силикагель60, Реакцию осуществляют на остатках 38 54(ОН ), полученных описаннымспосббом. Активные фракции, полученные иэ колонки ЭЙ 45 Упаривают досуха; уксусную кислоту вымывают водой,Полученный остаток суспендируют в40 328 мл воды и упаривают до 33 гсиликагеля. Колбу затем проживают5 г свежего силикагеля. Гомогенныйпорошок хроматографируют на колонне с силикагелем, полученным суспендированием 600 г,силикагеля в системе метилатилкетон-ацетон и вода (65;20:15), Элюируют этой же смесью (7200 мл) собирая вначале 1200 мп и затем фракции 1-12 по 500 мп,Результаты приведены в таблице.736875 5 Продолжение таблицы О -43,795 То жеСредняяТо же О -43,795+АТ - 125 57 АтАТАТ 70 Средняя/слабаяСлабая 70 60 То же 10 147 32 12 Наносят в виде капель разбавленные фракции 1-10В виде капель на пластину с силикагелем,,. В системе метилзтилкетон-ацетон-вода (65:20:15) на силикагельнойпластине; Обнаружение нингидрином.25фракции 3 и 4 смешиваюти упари-При ТСХ О -43,795 получаютвают.под пониженным давлением при зону послеопрыскивания пласти40 С, остаток растирают с метаноораствором нингидрина.Пластинылом, Получают 1,.37 .г чистого являют в системе тетрагидрофур0-431795, ПерекристаллиЪацией иэ -ацетон-вода (50: 30:20), В=О 5водного метанола получают"аналити- Химическая структура О -43,чески чистый О -43,795 в виде его в кристаллической форме устанокристаллического гидрата, Воду мож" днфракцией рентгеновскими луча.но удалить сушкой, о(Я 45 5 Й -А-амино-хло -4 ИК-спектр ньюелевой растирки частичного гидрата О -43,795 определяют спектрофотометром РегМп Е 1 юЕг 421,. Пики найдены при 3620, 3140, 2710, 2620,. 1660, 1640,. 1610,. 1585 1525, 1385, 1325, 1310, 1270, 1255 р1180, 1135, 1110, 1075, 980 915 800, 865, 805 н 705 см(5 Ь.-плечо). 55 формула изобретения Кольцевой дихроизм О -43795показывает в. воде /О/,1 + 60,000 и/О/д - 47,000,Полученный антибиотик О -43,795 характеризуется следующими свойствами:1ЯИР-спектр насыщенного раствора 0-43,795 в 0 О определяют спектрометром Уогонх /, -100-15. Спектр 100 мГц ясно показывает наличие трех незаменяемых протонов. Метиновый протон у Свиден в. качестве кажущегося дублета при 5,34 с линейным разделением 8,2 Гц. Соседний протон у Свиден в качестве кажущегося дублета дублетов, центрированных при 5,19 с линейным разделением 3,4 Гц и 8,2 Гц. Сигнал метина аминокислоты представляет собой кажущийся дублет при 4,43 с линейным разделением 3,4 Гц,однуныпро- ан 5,795нленамифр окси -2-йзоксаэолин-уксусная кислота,Мол. в. 212,59, Растворяется в водеи незначительно в метаноле, 1.)тноси,- тельно нерастворим в этилацетате,простом эфире бенэоле и хлороформе,Антибиотик 0 -43,795, являясь40 амфотерным соедниением, образует соли с кислотами, щелочнымн металлами (включая аммиак), щелочноэемель"ными металлами (включая магнийиалюминий) и аминами.0 -43,795 поддается ациллированиюс помощью соответствующего галлогенангидрида кислоты или ангидрида кислоты или сульфенилгалогенида, образуя соответствующее бис-ацильноепроизводное, где 4-гидрокислый ио-амино-водород ациллированы,Антибиотик Ц. -43,795 активен против Вас. 5 овЯь и 5 огсеи Ыео, мышиной лейкемии типа 1210,Способ получения антибиотика общей формулы нс 1 с-онФсн-сн-соо +н,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,культуру 51 гер(овусеВ эчСЕц Майа.45 5439 выращивают на среде, содержа736875 щей источники углерода, азота, мине-ральные соли, с последующим выделением целевого продукта известными приемюв,Источники информации принятые во внимание при экспертизе 1,Ацбе 1 сгоЬа 1 Аен 1 з она еЬевзйегар 9 03. 1973, УОФ 3, р, 425-431,Составитель Р, Смирнова Редактор А. Бер Техред М,Кузьма КорректорГ. Решетник Заказ 2465/50 Типам 522 Подписное БНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открьпий . 113035 Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП фПатент, г. Уагород, ул, Проектная, 4