Способ получения диагностических сывороток к вирусам растений

,ЯО А С 12 0 А 61 В 10/00 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 0-1 5 Бюп. Р 12унова иатский н А.Б. Соболевааучно-исслефитопатологии инстит 088.8) свидетельство СС2 К 1/04, 1975,и Попова Н.Н. Кагиза вирусов в ра Сельхозиздат,к С С ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОЮИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ(21) 2624426 (22) 03,05.7 (46) 30.03,8 (72) Н.И. Го (71) Среднеа довательский (53) 632.07 (56) 1. Авто 9 519472, кл2, Дунин пельный мето тениеводстве 1937 (протот(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТЧЕСКИХ СЫВОРОТОК К ВИРУСАИ РАСТЕНИЙ, включающий приготовлениеантигена путем размножения вирусовв ткани растения, гомогенизации зараженной ткани и ее осветления йпоследующей гипериммунизацией осветленным экстрактом лабораторныхживотных для получения сывороток,о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения специфичности сывороток в качестве ткани,на которой размножают вирусы, дляприготовления антигена используюткаллюсную ткань растений.рового растения- хозяина, в равных количествах для осаждения антигенноактивных веществ хозяина. Затем осадок удаляется центрифугированием, а супернатант, содержащий вирус, служит антигеном для получения антисыворотки к вирусу.Титры сывороток к Х-вирусу картофеля (ХВК), полученных этим способом, колеблятся в пределах от 1:128 до 1:512, а сыворотка к вирусу мозаики оси (ВИС) имеет невысокий титр.При использовании в качестве антигена неочищенного экстрагированного сока из листьев зараженныхрастений сыворотка получается неспецифичной. Серологический метод приготовления антигена предлагает адсорбцию из сока больного растенийбелков самого растения антителами к ним. Следовательно, для приготовления вирусного антигена требуетсясыворотка, специфичная к белкамздорового растения, на получениекоторой необходимо затратить дополнительное время и средства. Приналичии такой сыворотки с низкимтитром антител для полного осаждения белков растения следует добав" лять значительные объемы этой сыворотки, что приводит к большему расходу сыворотки, сильному разбавлению антигена и, в конечном итоге, к получению антивирусной сыворотки с низким титром. Кроме того, существует опасность неполного осаждения белков растения - хозяина, а, значит, возможность получения неспецифической сыворотки.Цель изобретения - повышение специфичности сывороток в качестве ткани, на которой размножают вирусы в Это достигается предлагаемым способом получения диагностических сывороток к вирусам растений, включающим приготовление антнгена путем размножения вирусов в ткани растения, гомогениэации зараженной ткани и ее осветления с последующей гкппериммуниэацией осветленным экстрактом лабораторных животных для получения сывороток. В качестве ткани, на которой размножают вирусы для приготовления антигенав,используют каллюсную ткань растений.Способ состоит в следующем. 3 693 704 2Изобретение относится к фитовиру- .-сам, преимущественно к серодиагкостике и может быть использовано всельском хозяйстве, в области защиты растений, в селекционных исеменоводческих хозяйствах, конкретно - для приготовления диагностических сывороток, служащих длядиагностики вирусных заболеванийрастений.30В настоящее время для приготовления сывороток к фитопатогеннымвирусам в качестве антигена используются,главным образом, очищенныепрепараты. Наиболее широко распространенным является способ дифференциального центрифугирования всочетании с химическим методомочистки 1.Процесс очистки, как правило,сложен и длителен: ряд предварительных обработок исходного материала с целью освобождения от балластных веществ - белков хозяина, пигментов, структурных компонентовклеток и т.п., несколько циклов дифференциального центрифугирования(одкн цикл состоит из осаждениявируса в ультрацентрифуге, суспендирозания осадка в буферном растзоре и умеренного центрифугирова 30ния) .Очистка вируса требует дорогостоящего оборудования и наличиявысококвалифицированных специалистов. При современном уровне препаративной техники очистить полностью препарат вируса от антигеновхозяина не представляется воэможньи. При недостаточном освобождении вирусного препарата от белковрастения специфичность сывороткине обеспечивается. Кроме того, впроцессе очистки зачастую теряетсязначительная часть вирусного материала, поэтому для получения очищенного антигена требуется пере"работать большую массу исходногорастительного материала.Известно использование в качестве антигена неочищенного экстрагированного сока 21.Способ состоит в следующем.Листья зараженных вирусом растений растираются с буфером, гомогенат центрифугируют (3000 об/мин, 5510 мин), супернатант смешиваетсяс. приготовленной заранее сыворот"кой, специфичной к белкам здоСодержание вирусов в культивируемых.каллюсных тканях ВМС с тканяхсои, Ж к числузараженныхрастений сои ХВК в тканях Пр одолжи- тельностьдурмана, число некрозов на лист мари бело культивирования с моглютинозы, числонекрозов на половину листа гомфрены мента выделения каллюса, мес. 49,6 + 4,8 63,1 + 3,5 65,5 + 6,6 71,3 + 2,0 15,9 + 3,6 36,43,8 33,6 ф 2,77,0 + 1,722 9 . 2,6 32,7 + 5 2 100 80 90 80 10 129,6 + 97 14 80 146,5 - 16, 1 70 3 6От растений определенного вида, зараженных соответствующим вирусом, в период его максимального накопления изолируется каллюсная ткань,Рост инфицированной ткани поддерживается путем периодических пере- севов (через каждые один - три месяца в зависимости от вида ткани) в течение длительного времени,Для приготовления антигена навеску каллюсной ткани, содержащей вирус, гомогенизируют в небольшом количестве 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0) в густую кашицу, которая отжимается через два слоя марли, Экстракт осветляют низкоскоростным центрифугированием (15 мин при 3 000 об/мин). Супернатант - жидкость кремового цвета, используют в качестве антигена.П р и м е р 1. Для получения высококачественных диагностических Осветленные низкоскоростным центрифугированием вытяжки из каллюсных тканей используются как антигены.Иммунизация проводится внутривенно возрастающими дозами через сутки. На восьмой день после завершения курса иммунизации берут пробу крови и определяют титр по капельной реакции на стекле. Таким способом были получены следующие сыворотки. 93704 4сывороток, специфичньм к ХВК, ВМС,изолируют каллюсные ткани из растений глютинозы (Я 1 согапа р 1 цСпоза Ь.Л либо дурмана (Эагогазггашопдцш), зараженных ХВК, а также иэ растений сои, зараженной ВМС.Установлено, что указанные вирусыв высокой концентрации и продолжительное время способны сохраняться 10 в каллюсных тканях (см. табл).Концентрацию вирусов определяютметодом индикаторов.Для ХВК таковым является гомфрена (СорЬгепа 42 оЮоза) и марь белая (СЬешоро дасеае аТЬош), дляВМС - растения сои.Раз Рведенные в культуру каллюсные ткани растений, зараженные соответствующими вирусами, могут 20 в течение года и более служить источником вируса и использоваться в качестве .антигена. 1.К ХВК при использовании в качестве антигена каллюсной ткани 50 глютинозы с титром 1:256 после пяти инъекций, с титром 1:512 - послереиммунизации.2. К ХВК при использовании в качестве антигена каллюской ткани 55 дурмана с титром 1:128 после пятиинъекций.3. К ВМС при использовании в качестве антигена выраженной каллюс.693764/ной ткани сои с титром 164 после щепяти инъекций. ра 10 Редактор Л. Письман Техред С,Мигунова Корректор А. Тяско Заказ 2400/3 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная,4 Наработка антигена при использовании субкультивируемой каллюсной ткани проста, экономична, размножение вируса в такой ткани надежно обеспечивает чистоту штамма на протяжении периода иммунизации. В этом случае налицо преимуство каллюсной ткани перед живыми стениями, выращенными в теплице.Другое полезное свойство каллюсных тканей - отсутствие зеленого пигмента - хлорофилла, недостаточное освобождение от которого часто является одной из причин неспецифичности антивирусной сыворотки, полученной при использовании интактных растений.