Штамм 147-а -продуцент кислотоустойчивой -амилазы и глюкоамилазы

Союз Советскнк Социапистичесинк РЕСпУбяНК(5) М Кл С 12 К 1/02 С 12 П 13/10 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 3004,79(71) заявитель Институт биохимии растений АНГрузинской ССР(54) вТАММ Дэрег 5 Ииэ п(ег 147 - А ПРОДУЦЕНТ КИСЛОТОУСТОЙЧИВОИ о -АИИЛАЗЫ И ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Изобретение относится к Ферментной промышленности, в частности, к получению нового штамма - продуцента амилолитических ферментов, кислотоустойчивой й -амилазы и глюкоамилазы.Для получения амилолитических Ферментов в настоящее время используют отдельные представители 65 регфЮ- сиб: .огутае, А,оюаппог(, А.озае,А.о-. фег. При культивировании этих микроорганизмов получают сб -амилазу некислотоустойчивогохарактера и кислотоустойчивую с 6 -амилазу в следовых количествах, глюкоамилазу и трансглюкозилазу, которая, как известно, образует олигосахариды соо -1,б связью и тем самым затрудняет Ферментативный гидролиз природных крахмалов.Кислотоустойчивая сс, - амилаза АБрегфИоб полностью сохраняет активность при рН 20 и 30-ти мин инкубации при температуре 30 , в то время как кислотоустойчивая Ж-амилаза этих же грибов при рн 3,0 в тех же условиях полностью и необратимо теряет активность. Из известных штаммов наиболееблизким по технической сущности идостигаемому эффекту является плесневый гриб АбрЕГДИиб П 1 фЕг штамм б 475 - продуцент кислотоустойчивойо(-амилазы, глюкоамилазы и трансглюкозилазы 1),Недостатком данного штамма яв ляется низкий уровень биосинтезакислотоустойчивой а(, -амилазы (0,65 ед/мл), Кроме того, А 5 регфИвб пфег 475 образует фермент трансглюкозилазу, отделение которого 5 связано с большими техническимитрудностями. Целью настоящего изобретения является получение штамма - более актив- вО ного продуцента кислотоустойчивойс(-амилазы и глюкоамилазы, которыйпри этом не:продуцировал бы нежелательный продукт - трансглюкозилазу.х 5 Новый штамм получен путем ультрафиолетового облучения исходногоштамма АбрЕгф Иий ПрЕг 475.Исходный и мутантный штаммы хранятсяв музее. коллекции культур Института ЗО биохимии растений АН Грузинской ССР,,Мрегб(ИОБ п(бег Полученный штамм имеет след 1 юшуюморфологическую и Физиологическуюхарактеристики.Морфология,У пятисуточцой культуры гифы тонкие и толстыеразделенные ца равныепрямоугольные клетки, Конидиецосцыбесцветные, несептированные, неветвящиеся размером (330-858)х(6,6. -13,2) мк, средний их размер 660 хх 9,9 мк. Конидиальцые головки радиальные, 10Коцидиальцые пузырьки круглойФормы диаметром 26,4-66,0 мк, средний диаметр 46,2 мк,Стеригмы цилиндрические, двурядные, причем первичные длиннее вто- (5ричцыхРазмер стеригм первого порядка 13,2-19,8 мк, В, среднем 152 мк,Стеригмы Второго НОряДка размером4,6-9,9 мк в среднем б,б мк,Иа стерягмах расположены конидяи,круглые, диаметром 4,6-115 мк, средний диаметр 6,6 мк.Органическая среда.Пятисуточная гигантская колонияплоская круглаяф Диаметром 9 10 сиКонидиальные головки крупные в центре колонии, мелкие по краю. Конидиеношение обильное светло-коричневое,Стерильный край колоний 0,5-1,0 см.Минеральная среда (г/л) ."ИаЫО,0; КН 2 Р 04- 1,0, Мд 304-0,5;80крахмал - 20,0; пшеничные отруби -4 Ъ.Рост колоний в виде гомогенной кашицеобразной массы светло-коричневатогоцвета.Отношение к источникам углерода.ГНДрОлизует амялозур амилопектини Лодобные поли- и олигосахариды соь -16 глюкановой связью. наблюдается интенсивный рост на среде, содержащей глюкозу, сахарозу и мальтозу 40В качестве единственного источникауглерода. Отношение к источникам азота,Азот нитрата усваивает легче, чем азот аммония. Наиболее интенсивный рост наблюдается на нитратах. Отношение к источникам Фосфора.усваивает разнообразные ФосФорныесОедянеция в том числя и Р трехвалецтцой Форме,На среде, содержашей крахмал вкачестве источника углерода, синтезирует кислотоустойчивую об -амилазуя глюкоамилазу, В этих же условияхпротеолитические Ферменты синтезируются в следовых количествах.Активность по кислотоустойчивойМ -амилазе - 1,5 ед/мл, по глюкоамялазе - 12,1 ед/мл.П р и м е р 1. Штамм/врегфИоб п(ЕР147-А получен путем облучения ультраФиолетовыми лучами В дозе 3,2 хх 10 зрг/см конидий исходного штам 5 2мабрегб(йобвфег 475, Культивирование мутанта проводили на среде следующего состава (г/л):1)(м Н .с. 4,0Кйр РОЯМфб 04Крахмал 200Пшеничныеотруби 4,0при 30 С на качалке (180 об/мин) втечение 72 час,Посевным материалом служила суспензия конидяй грибов, Выраценныхна скошенном сусло-агаре в течение20 суток, Грибы культивировали Вкоябах объемом 750 мл, содержаших150 мл среды.Параллельно вырашивали АерегфИобп(бе 1 475. Данные лабораторной проверки культуральной жидкости на актявность Ферментов амилолитическогокомплекса нами полученного штамма,в сравнении с известным АзрегдНЮБпх 9 ег 475 пряведены и табл, 1.Активность сб -амялазы определяли колоримстрическим методомРухлядевой и Горячевой. Активностьглюкоамилазы определяли по Дальквисту, а об активности трансглюкозилазысудили по способности Фермента образовывать олигосахара из мальтозы(наличие на хроматограмме пятна изомальтозы и панозы) .659617 Как видно из таблицы, полученный штамм АерегЯеГ(об пеЦег 147-А, отличающийся от АбрбгфИВЕ пефвг 475 по морфологическим и биохимическим признакам,.обеспечивает повышенную активность кислотоустойчивой р -амилазы, а также отсутствие нежелатель ного фермента трансглюкозилазы.Кислотоустойчивую Ж -амилаэу с успехом можно использовать в тех отраслях пищевой промышленности и медицины, где процесс применения Я Фермента сопряжен с кислым значением рН среды, например, в хлебопекарной промышленности, когда при внесении жидких дрожжей рн среды резко падает. Использование указанного штамма будет эффективно также в спиртовой проещшленности.При энзимотерапии важную роль играет кислотность желудочного сока, подавляющего активность Ферментов, в этих условиях кислатонеустойчцвая Ж -амилаза полностью теряет активность, в то время как кислота- устойчивая сб -аиилаэа сохраняет более 90 энзиматической активности.П р и и е р 2. 8 мг Ферментного препарата кислотоустойчивой а 6 Т а б л и ц а 2 Количество взя- ТОГО препаратае Врееея тестозеденияе Объем Формонаименование препаратаВотахлеба,С Е час кукг хлеба 1 ПО предлагаемому 535 Па прототипу:амилоризин П 10 Х 10 Контрольныйвариант 2,36 470 эы и глюкаамилазы. Хранится .В музее коллекции культур Института биохимии растений АН Грузинской СССР.Морфологичебкие признаки.у пятисуточной культуры гифы тон"к не и тОлстые 5 разделенные еаза равеееЗе прямоугольные клеткн, Конидиеносиы бесцветные, несептированные, неветВящиеся, размерам (330-858)х(6,6- 13,2)мк, средний размер 660 х 9,9 мк, 5 Конидиальные головки радиальные. способу:препарат из КЯ АбрЕгбе- Ецб ЛДЕг йт- А Хлеб 5 выпеченный с добавлением Ферментного препарата кислотоустойчивойее(,-амилазы и глюкоамилазы иэ Аерегфеббиб пеДег 147-А, Отличается лучшими вкусовыми качествами, более замедленным процессом черствения и более равномерной структурой пористости,Формула изобретения Штамм АЕрЕгфеГРНЕ пфвг 147-Апродуцент кислотоустойчивой е., -змилаамилазы и глюкоамилазы АврегфИеен пбее 1 147-А, полученного Осаждением зти- ЛОВЫМ СПИРТОМр С аКТИВНОСТЬЮ КИСЛО тоустойчивой о., -амилаэыед/г и глюкоамилазыед/г Вместе с 415 мл воды, 10 г хлористого натрия и 20 г дрожжей интенсивно перемешивают с 740 г муки первого сорта да получения однородного теста, затем ставят в термастат (30 с) на два часО(перемешивают тесто через каждый хас), Полученное таким образом тесто делят на две части и выпекают Формовой и подовой хлеб. Параллельно в аналогичных условиях выпекают хлеб с добавлением амилаоизина П 10 Х"Ферментнога препа рата, который В настоящее время применяется В СССР как добавка с целью улучшения качества хлебобулочных изделий, и контрольеий варинт - без добавления Фегментного препарата,В табл,2 приводятся данные использования Ферментных препаратов кислотоустойчивой а 5 -амилаэы и глюкоамилаэы АбреефеМВБ е 1 ефег 147-А, амилоризина П 10 Х и контрольнага Варианта (без Внесени 5 е Фермента),659617 15 Конидиальные пузырьки круглойформы диаметром 26,4-66,0 мк, средний диаметр 46,2 мк.Стеригмы цилиндрические, двурядные, причем первичные длиннее вторичных. Размер стеригм первого порядка 13,2-19,7 мк, в среднем 15,2 мк. 5Стеригмы второго порядка размером4,6-9,9 мк,в среднем 6,6 мк.На стеригмах расположены конидии,круглые, диаметром 4,6-11,5 мк,средний диаметр 6,6 мк. 30Культуральные признакиОрганическая среда. Пятисуточнаяколония плоская, круглая, диаметром9-10 см.Конидиальные головки крупныев центре колонии, мелкие по краю.Конидиеношение обильное светлокоричневое. Стерильный край колоний0,5 - 1,0 см.Минеральная. среда (г/л):ЧаМО 5-4,0 У КН РО 4 - 1,0 /йф 504 -крахмал - 20,1; пшеничные отруби4. Рост колоний в виде гомогеннойкашицеобразной массы светло-коричневого цвета,Отношение к источникам углерода. 25Гидролиэует амилозу, амилопектин и подобные поли- и олигосахариды сФ, - 1,6 глюкановой связью,Наблюдается интенсивный рост насреде, содержащей глюкозу или сахарозу или мальтозу в качестве единственного источника углерода.Отношение к источникам азота,Азот нитрата усваивает легче, чемазот аммония. Интенсивный рост наблюдается при использовании нитратов.Отношение к источникам фосфора.Усваивает фосфорные соединения. Насреде, содержащей крахмал в качествеисточника углерода, синтезирует кислотоустойчивую сб -амилазу и глюкоамилазу, в этих же условиях протеолитические ферменты синтезируются вследовых количествах. Предложенный штамм характеризуется повышенной активностью, а также отсутствием нежелательного Фермента трансглюкозилаэы. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Прикладная биохимия и микробиология 1 ф, 1975, т.Х 1, вып.4.Составитель М,ЛаринаРепакторН Грязнова Техред С,Мигай Корректор О,БилакЗаказ 2120/6 Тираж 525 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва, ЖРаушская наб. д.45Филиал ППП фПатентф, г.ужгород, ул.Проектйая,4