Способ количественного определения активности сс-амилазы в биологических жидкостях

Союз созетскихСоциалистическихРеспублик 396036ИЗОБРЕТЕН ИЯ Зависимый от патента-М. Кл. 6 01 п 33,16 Заявлено 19 Х 111.1969 ( 136200123-4)Приоритет 19.И 111968, ЪЪ 753748, СШАОпубликовано 28 Х 111.1973. Бюллетець М 35 Государственный комитет Совета Министров СССР оа делам изооретений и открытийУД 1 543 9 0(8(088 8) Дата опубликования описацця 31.1,1974 Иностранцы Бернхард Клейн и Рональд Лой Серси(Соединенные Штаты Америки) Иностранная фирма ф. Хоффманн Ля Рош и Ко, АГАвторыизобретени явител ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ КОЛ ИЧ ЕСТВЕН НОГее 1 ИЛАЗЫ В БИОЛ СПОС водой, окраски и станразоавля ецсцвцость ют с окра Сцы ю смесь пруОт и ш тата соцоставл пробы,Пол ентрифцентриф дартцой Изобретение относится к аналитической химии фермсцтов, а емеешо к сгОсооа 1 1.Олцчсствсццого определения активности амилазы, содержащейся в биологических жидкоСТ 5 Х.Известен способ количественного определен 151 1 кти 1 ИОст:1 ал 1 цлазы В некоторых оиологи 1 еск 1 х 5 кидкостях при ГОмощи диццтроса;11 ц.1 ОВО 1 кслоы для Определения кол 11- чества госстацавливаюших групп, освобож дающихся цри гидрол:Езе крахмала, каталцзируемом амцлазой. Однако, при проведении способа необходимо строго соблюдать условия фермсцтативцого расщепления крахмала, вследствие этого точность определения недо статочцо Высока.Для повышения точности анализа предлагается способ количественного определения активности и-амисазы в биологических жидкостях, заключающпцся в то.;1, что водоцера створцмый комплекс водораствори.,ого реакИвцого красиея с содержащим амцлозу вещество:1 в водцом фосфатцом буфере тодвергают эцзцматцческому действию исследуемой биологической жидкости в присутствии 25 каталзатора, например хлорида щелочного металла, с последующим сравцешСм цвета получеццой жидкости со стандартом.Процесс:келательцо вести цр; рН 6,9 - 7,1 ц црц температуре 37 - 40 С, а в качестве комплекса реактивного красителя исцользоВать е:Омпле.с, 1 срасе 1 тслЕПая к 01 поцсцтее 1.0- торого представляет сооой молохлортриазиц с ацтрахицоцдцс льфоцатцым заместителем.При определении акт:вности а-амилазы водонерастворпмый комплекс реактивного красителя, цапрцмер Ццоакрона блестяще-синего ГЗСеА (рсактивцого синего 2) ли Цибакроца олест 5 ще-орацжевого ЕЕ (реактивного оранжевого 5), с содержащим амцлазу материало:,1, суспецдируют в водном растворе нейтрального фосфат 110 го буфера црц рН 6,9 - 7,1 и хлор;да щело:ИО 10 металла. сусг.сцзио цагревают до 37 - 40"С, вводят аца- ЛИЗИРСЕМО ЦРООУ ОИОЛОГИ 1 ССКОЦ жи,ЕКОСТЦ через 15 .чин реакцию останавливают,пбо путеъ поццжспцЯ, либо пОВышецця р 11.396036 Предмет изобретения Составитель С. Хованская Текред 3, Тараненко Корректор Л, Царькова Редактор О. Кузнецова Заказ 12524/13 Изд,975 Тираж 755 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская нао., д. 4/5Малоярославецкая городская типография Калужского областного управления издательств, полиграфии п книжной торговлиИзготовление красильного крахмального комплекса.А. 10 г Цибакропа блестяще-синего ЕЗУСА в 1 л воды прибавляют к суспензии 100 г амилозы в 1 л воды при 50 С и при 5 пе 1 ремешивании. Потом медленно и при перемешивании вводят втечение 30 мин 200 г безводного сульфата натрия, затем 150 лсл 10%- ного раствора тринатрийфосфата. Для прохождения реакции реакционную смесь пере мешивают 75 мин при 50 С.Полученную суспензию перемешивают в течение ночи при комнатной температуре, вводят в центрифугу и центрифугируют 20 мин при 2500 - 3000 об/мин, Полученное 15 тве 1 рдое вещество промывают, егце раз центрифугируют и сушат.1 аким образом получают синий порошкообразный материал, представляющий собой один комплекс амилозы и Цибакрона бле стяще-сипего гЗСзА, содержащий в амилозе приблизительно 7 - 10 ч. сахара на молекулу красителя.Б. Употребляя вместо Цибакрона блестяще-синего ггЗСтА в качестве красителя Циба крон блестяще-оранжевый СсЕ, поступают согласно пункту А и получают оранжевый порошковидный материал, представляющий собой один комплекс амилозы и Цибакрона блестяще-оранжевого СсЕ,содержащий в ами лозе 7 - 10 ч. сахара на молекулу красителя.Пример. Определение активности и-амилазы.В колбе Эрленмейера на 25 мл суспендируют 200 мг комплекса реактивного ра сителя с амилозой в 4,5 лсл 0,04 М раствора фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 0,05 моль хлорида натрия, суспензию нагревают до 40 С. К нагретой суспензии прибавляют 0,1 - 0,4 мл исследуемой пробы биоло гической жидкости, например экстракта поджелудочной железы свиньи, и через 15 мссн 1 мл 2-амино-метилпропанолаили 2 лсл 1 и,уксусной кислоты, после чего смесь разбавляют водой до 10 м,г и центрифугпруют. Измеряют оптическую плотность центрифугата по отношению к раствору стандартной пробы, Стандартную пробу готовят по описанным данным, причем вместо пробы анализируемой жидкости используют 0,4 мл воды.Калибровочную кривую строят путем из мерения оптической плотности растворов краоителей, содержащих 100 - 400 мкг красителя в 1 О,ил. В случае красителя реактивного синего 2 измерения выполняют при б 25 нм, а в случае красителя реактивного оранжевого 5 при 490 нм. Активность амилазы выражают в количестве красителя в милли- граммах, освобождаемом 1 мл анализируемой пробы,1, Способ количественного определения активности сс-амилазы в биологических жидкостях, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа, водонерастворимый комплекс водорастворимого реактивного красителя с содержащим амилозу веществом и водном фосфатном буфере подвергают энзиматическому действию исследуемой биологической жидкости в присутствии катализатора, например хлорида щелочного металла, с последующим сравнением цвета полученной жидкости со стандартом.2. Способ по п, 1, отличающийся тем, что при определении активности а-амилазы процесс ведут при рН 6,9 - 7,1 и температуре 37 - 40 С.3. Способ по п, 1, отличающийся тем, что в качестве комплекса реактивного красителя используют комплекс, красильная компонента которого представляет собой монохлортриазин с антрахинондисульфонатным заместителем.