Способ титрации овисных антигенов

) М. Кл. С 12 К 1/ 2) Заявлено 05.0 1.77 (21) 2442956/30 вкирисоединением осударстве СС по делам и откиыи комитесгзобретеиийрытий 3) Приоритет 5768 (088. нь 9 публиковано 050379 Бюлл ата онублико ИЯ 07.03.7 ния опнс 72) Авторы изобретения П У.Э. Ниязов,ков усова(71) Заявител союзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов) СПОСОБ ТИТРАЦИИ ОВИСНЬ 1 Х ЕНО областик спосонов, иетеринарри контрот овисеакции, а следователь по этим сывороткам енов различной актив ительность о, получени висных анти ости.Целью изо ение специф и и упрощенУказ нная в ем ую 10 Изобретение относится кмикробиологии, в частностибам титрации овисных антиге может быть использовано в в ной лабораторной практике п 5 ле специфичности и активнос и ных антигенов.Известен способ титрации овисных антигенов в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), включающий разведение и инактивацию сывороток, разведение антигенов, титрацию комплемента, выдерживание бактериологической и гемолитической системы в холодильнике при 0-4 С в течеоние 16-18 ч, добавление оттитрованной дозы гемолитической системы, выдерживание в водяной бане при 37 С в течение 20 мин и учет реакции через 3-4,и 24 ч 1 и 2).20Недостатками описанного способа являются использование нестандартных сывороток, активность которых снижается в зависимости от срока хранения; невозможность концентрирова- об ния используемых сывороток до нужных значений; большое количество разведений сывороток; влияние неспецифических белков, содержащихся в сыворотках, на специфичность и чувст бретения является по ыш ичности, чувствительност ие реакции.а цель достигается т что в качестве антител использ т лиофилизированный полиглобулин.Полученйе полиглобулина. 500 мл неконсервированной овисной сыворотки, полученной от одного или нескольких животных, нагревают до 40-42 С,о измеряют рН и при необходимости доводят до 7,5-7,6 0,1 н. раствором МаОН или НС 0, затем помещают в предварительно прогретый стакан гомогенизатора, добавляют 1,5 порошкообразного риванола (2-этокси,9-диаминоакридинлактата) и гомогенизируют в течение 3 мин при 2-2,5 тыс.об/минПолученную вспененную массу фильтруют через капроновую ткань. Фильтрат помещают в холодильник при Т=4-7 С на 2-3 суток для отделения свободного риванола. Затем раствор профильт ровывают через фильтровальную бумагу и в полученном прозрачном растворе определяют содержание белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом, а также чистоту полученных фракций и нативность белка зональным электрофорезом на бумаге. При этом чистота белковых фракций должна сос=авлять 955,0, а содержание белка в растворе - 2-3. По лученный раствор разливают в ампулы по 3 мл и высушивают лиофильно. Остаточная влажность должна быть не более 3. После высушивания полиглобулина определяют количество сухого 10 вещества в мгв 5-6 ампулах (или Флаконах) и выводят средний вес в одной ампуле (флаконе)После сушки раствор полиглобулина должен иметь рН 7,2-7,4, чистоту белковых фрак ций 95 сО+5,0П р и м е р. Способ титрации овисных антигенов с применением полиглобулиыа.Компоненты, используемые для титрации овисных антигенов в РДСК: раствор полиглобулина, содержащий в 1 мл 100 мг сухого вещества; испытуемые антигены; физиологический раствор с рН 6,8-7,0; негативные сыворотки баранов; Я-бруцеллезная сыворотка; овисный антиген с известной активностью и специфичностью в рабочем разведении (1:100); антиген бруцеллезный для РСК в рабочем разведении (1:100)р комплемент сухой для РСК активностью в бактериологической системе (в разведении 1:20), не ниже 0,31; сыворотка гемолитическая для реакции связывания комплемента с титром не ниже 1:2000; 4-ная взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе.Перед постановкой реакции рабочий раствор полиглобулина и Я-бруцеллезную сыворотку разводят физиологичес ким раствором 1:5 и 1:10, а две негативные сыворотки - в соотношении 1:5. Испытуемые антигены разводят физиологическим раствором до 1:300- 1:500 (до предельного титра) . Конт рольные овисный и бруцеллезный анти- гены разводят физиологическим раствором 1:100. Комплемент разводят физиологическим раствором 1:20-1:30 в зависимости от титра.Гемолитическую систему готовят из равных объемов 4-ной взвесиэритроцитов барана в физиологическом растворе (из осадка эритроцитов, промытого 2-3 раза на центрифуге) и разведения в четвертом титре гемолитической сыворотки.Последовательность способа титрации овисных антигенов в РДСК показана в табл. 1, Титрация гемолитической системы и определение ее рабо чей дозы главного опыта представлены в табл. 2.Полиглобулин, негативную и Я-бруцеллезную сыворотки разливают в пробирки по 0,5 мл. 65 Для титрования гемолитической системы две негативные сыворотки разливают в 10 пробирок по 0,5 мл.Полиглобулин и сыворотки, разлитыев пробирки, инактивируют в водянойбане при 64-65"С в течение ЗО мин.Испытуемый антиген разливают по0,5 мл в пробирки с полиглобулином,негативной и Я-бруцеллезной сыворотками.Контрольный овисный антиген разливают по 0,5 мл в пробирки для титрования гемолитической системы и в контрольный ряд пробирок с полиглобулином, негативной и Я-бруцеллезной сыворотками. Комплемент разливают вовсе пробирки по 0,5 мл,Все пробирки главного опыта и гемолитической системы выдерживают16-18 ч при 0-4 С и 20 мин при комнатной температуре.Затем титруют гемолитическую систему для определения ее рабочей дозы. Оттитрованную дозу гемолитической системы разливают во все пробиркиглавного опыта и выдерживают в течение 20 мин в водяной бане при37-38 С.Результаты реакции учитывают дважды: через 3-4 ч и через 24 ч. Реакцию оценивают в процентах гемолизаэритроцитов.Антиген считается специфичным,если в разведении 1:25 и выше с негативными сыворотками в разведении1:5 и с Я-бруцеллезной сывороткойв разведении 1:5 и 1:10 не вызываетзадержки гемолиза.Антиген не должен обладать антикомплементарными свойствами, т.е.в контроле без сыворотки не долженвызывать задержки гемолиза эритроцитов.Титром овисного антигена считается наибольшее его разведение, дающее полную задержку гемолиза эритроцитов с разведениями полиглобулина1:5 и 1:10. Овисный антиген при тнтрации на полиглобулине должен выпускаться с двойным-тройным запасом активности (1:200 - 1;300) и применяться в разведении 1:100 (рабочий титр).При титрации антигена ставят следующий контроль:1. Контроль антикомплементарныхсвойств полиглобулина и сывороток.К 1,0 мл полиглобулина или сыворотки в разведении 1:5 добавляют 0,5 микомплемента и рабочую дозу гемолитнческой системы. Результат - полныйгемолиз.2. Контроль антикомплементарньжсвойств антигенов. К 1,0 мл антигенав разведении 1:100 добавляют О,Б зеикомплемента и рабочую дозу гемолитической системы. Результат - пслныйгемолиэ.3. Контроль гемотоксичностн антмгенов. К 1,0 мл антигена добавляют651026 Таблица 1 Схема титрации овисного антигена Компоненты реакцииРазведение антигена1 1 200 2 Разведение поиглобулина/сыоротки/ 5 0,5 0,5 Оу Водяная баня п,5 0,5 О,5 О,Испытуемыйантиген 5 Ор 5 О 5 0 Комплемент вразведении потитру 5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Выдерживание 16-18 ч при 0- при комнатной температуре 5 0,5 0,5 0,5 С и 20 мин Гемолитическая система в рабочем титре (см. схему титрации гемолитич системы) 0 1, Водя 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1 я баня при 37-38 С в течение 20 ми0,5 мл Физиологического раствора и рабочую дозу гемолитической системы. Результат - полная задержка гемолиза.4, Контроль резистентности эритроцитов. К 1,5 мл Физиологического раствора приливают рабочую дозу гемоли тической системы. Результат - полная задержка гемолиза. Применение лиофилизированного полиглобулина вместо овисных сывороток, используемых в РДСК, имеет следующие преимущества: а) реакция антиген-антитело проходит более быстро и специфично, так как создаются условия для прямой свя- )5 зи соответствующих детерминантных групп антигена и антитела; кроме того, значительно снижается роль неспецифических реакций;б) вместо двух овисных сывороток разной активности используется один компонент - стандартный полиглобулин;в) титрация антигена проводится в 1-2 разведениях полиглобулина вместо 12 разведений двух овисных сывороток;г) в связи с отсутствием в поли 25 глобулине балластных белков, не обладающих иммуногенной активностью, обеспечивается высокая специфичность реакции (РДСК); д) благодаря применению полиглобулина вместо сывороток значительно повышается чувствительность реакции;е) полиглобулин можно сконцентрировать до требуемых значений, поэтому его активность можно рассчитывать по содержанию в нем сухого вещества в 1 мл раствора и тем самым его стандартизировать;ж) срок хранения лиофильно высушенного полиглобулина практически не ограничен при стабильном сохранении всех свойств;з) в отличие от овисных сывороток голиглобулин дополнительно контролируется по иммунохимическим и физико-химическим показателям (чистота иммуноактивного белка, содержание его, нативность и т.д.), т.е. для реакции применяется компонент с заведомо известными свойствами;и) при постановке РДСК сокращается время и расход материалов на проведение титрации антигена,Титрация овисных антигенов различных серий с применением полиглобулина показала более высокую специфичность, чувствительность реакции и более простое осуществление способа, чем в случае применения двух овисных сывороток разной активности. о64-65 С в течение 30 мин 5 0,5 0,5 0,5 0,5 0651026 Таблица 2 Схема титрации гемолитической системы для реакции длительного связывания комплементаДозы компонентов (мл) в пробирках Компоненты Негативнаясь коротка введении 0,5 0,5 0,5 0 в течение 30 мин,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Водяная баня при 64-65 нтиген в очем тит 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 05 О,Комплемент (в том же разведении, как для главн.опыта) 0,5 0,5 0,5 0,5 Выдерживание 16-18 при комнатной темпе 0,5 020 мин,5 О, при 0- туре Гемолитическая система 1,8 2,020 минЧГ ЗГ1,2 мл1,0 мл 1,2 1,38 фС вПГ ЧГеской сбочий т 0,4 0,6 0,8 1,0Водяная баня при 37ПГ ПГ ПГ ПГОбщий титр гемолитир 1,6 ечени ЧГ стемызультат ПГ - полныйлиз ЗГдится паралворотками. а н и м Формула изобретения 35 рукция по изгоовисного анти- СХ СССР, 1972. Диагностика инмита баранов сринария, 1970 Составитель В. Радьковедактор Т. Орловская Техред И.Асталош Корректоро . Билак аказ 736/27 Тираж 527 ЦНИИПИ Государственного по делам изобретений 035, Москва, Ж, РаушПодписноекомитета СССРоткрытийкая наб д, 4/ иал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Способ титрации овисных антигенов в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), включающий разведение и инактивацию сывороток разведение антигенов, титрацию ком племента, выдерживание бактериологической и гемолитической системы в холодильнике при 0-+4"С в течени 16-18 ч, добавление оттитрованной дозы гемолитической системы, выдер живание в водяной бане при 37 С в течение 20 мин и учет реакции чере 3-4 и 24 ч, о т л и ч а ю щ и й гемолиз, ЧГ - частичный гемоадержка гемолиза. Опыт проволельно с двумя негативными сыс я тем, что, с целью повышения специфичности,чувствительности и упро щения реакции,в качестве антител используют лиофилизированный полиглобулин.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Временная инс товлению и контролю гена для РДСК, ГУВ2. Триленко П.А. фекционного эпидиди помощью РДСК, Вет Р 8, с. 107-109.