Способ получения фосфолипидов

-исследорукторский уч нс пдленност ацда 1 Ваг 1- сйа 1 гаЪагг 1. У 8, р. 1661 2, 196 зоп К,М.С. В 1 оспещ05-210 (прототип) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТ(71) Среднеазиатскийвательский и проектноинститут пищевой пром(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ путем ферментативной ерификации лецитина фосфолипазои Эв присутствии спиртовых акцепторови активатора в буферном растворе,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повьппения выхода целевогопродукта, сокращения продолжительности процесса, в качестве активатора используют гексан при соотношении реакционной смеси, спиртовогоакцептора и гексана 15:(2-10):(1-3);при этом используют фосфолипазу О,полученную из корнеплода среднеазиатской редьки Карцапцз ваг.гчцв вколичестве 0,02-0,04.Изобретение относится к технической биохимии, а именно к способам получения фосфатидов, и может быть использовано в масложировой, кондитерской, хлебопекарной отраслях пищевой промьппленности, а также в медицинской и фармацевтической промьппленности.Осуществление этого способа в отсутствие активаторов неэффективно, 1 О выход фосфолипидов очень низок и составляет 1,2-12,27 для различных спиртовых акцепторов.В связи с этим для повышения выхода фосфолипидов в известных способах применяют различные активаторы.Известен способ получения фосфолипидов путем ферментативной переэтерификации лецитина фосфолипазой Р из листьев капусты путем использо- р 0 вания в качестве активатора больших количеств диэтилового эфира (507 от объема реакционной смеси).Реакцию проводят при 25 в течение одного часа, рН среды составляет 25 5,8 а О, И ацетатном буфере. Расход ферментного препарата 250 г на 1 моль лецитина.Выход реакции в этом случае достигает 287. 1,30Недостатком данного способа является длительность процесса и большой расход катализатора.Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ полу-З 5 чения фосфолипидов путем ферментативной транспереэтернфикацией лецитина с использованием в качестве фермент- ного препарата фосфопипазы Р из40 листьев капусты и использованием в качестве активирующего воздействия обработку ультразвуком. Выход фосфолипидов (соответствующий проценту лицитина, превращенного в другие фосФолипиды) достигает 207.45В качестве активатора реакции используют также анионный детергент додецилсульфат натрия, при этом выход получаемых фосфолипидов составляет 18-327., а в оптимальных условиях 50 проведения процесса она может достигнуть 467 Реакцию проводят при 27 при рН 5,4 в 0,1 М ацетатном буФере в течение 50 мин. Расход фермент- ного препарата 120 г на 1 моль лецитина, 2 .Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта, сокращение про 1должительности процесса.укаэанная цель достигается тем,что в способе получения фосфолипидовпутем ферментативной переэтерификации лецитина фосфолипаэой Р в присутствии спиртовых акцепторов и активатора в буферном растворе в качествеактиватора используют гексан присоотношении реакционной смеси, спиртового акцептора и гексана 15:(2-10):;(1-3), при этом используют фосфолипаэу Р, полученную из корнеплода среднеазиатской редьки ВарЬапия яа 1 чияв количестве 0,02-0,04,Способ осуществляют следующим образом.На первой стадии готовят суспензию лецитина в воде, используя гомо.генизатор РТс числом оборотов8000 об/мин (в течение 10 мин),К 1, 25 л приготовленной такимобразом суспензии при перемешиваниидобавляют последовательно 2-10 лспиртового акцептора, О, 1-2,0 л раствора хлористого кальция с концентрацией 50 г/л, 0,1 л ферментного раствора с концентрацией 0,3-10 г/л,15 л одного из двух буферных растворов (ацетатного или трнс -НСР) и водудо конечного объема 25 л.К приготовленной смеси добавляютактиватор гексан в количестве 1-3 лои проводят реакцию при 5-45 С в течение 10-180 мин. После окончанияреакции к ней добавляют равный объемхлороформа для остановки реакции иэкстракции фосфолипидов и хлороформенный слой отделяют декантацией.Обработку хлороформом повторяют дважды. Объединенные хлороформенные вытяжки фосфолипидов отгоняют под вакуумом (40 мм рт.ст.), используя роторный испаритель с числом оборотов40-60 об/мин. После отгонки растворителя целевой продукт растворяют вхлороформе до концентрации 107. и добиваются окончательной очистки егопропусканием через колонку с силикагелем марки КСК В 2. Соотношение силикагеля и фосфолипида составляет 15: 1.Колонка промывается смесью хлороформ-метанол сначала с соотношением 9: 1 и при этом вымывается целевой продукт, затем с соотношением 2:1 для вьпчывания непрореагировавшего Фосфолипида.1082374 Выход фосфолипидов, % по способу Фосфолипид предлагаемому известному Фосфатидиловаякислота Фосфати- Исходдиловая ныйкислота продукт Исход- Целевой ный продукт продукт Целевой продукт Фосфатидилметанол 6,7 86,3 43,5-54;3 3,2-6,4 53,3-39,3 7,0 Фосфатидилэтанол 3,2 84,6 27,0-47,3 4,3-7,8 68,7-44,9 12,2 Фосфатидилпропанол 2,5 92,8 28,5-45,0 5,7-8,5 65,8-46,2 4,7 Таблица 2 Выход фосфолипидов, % от исходного лецитинапри количестве активатора, мл/л рН средыСпиртовый акцепто 40 80 1.201 50 С ЗООС 450 С 5 С 30 С 450 Г 5 оС 30 С 45 С 5,6 12,4 50,3 54,4 12,1 50,0 47,8 11,5 47,7 43,5 7,2 10,2 361 40,6 10,8 38,4 37,5 9,6 35,5 26,4 5,6 8,0 30,0 47,3 9,00 34,7 47,1 7,8 27,0 30,3 7,2 7,3 25 рО 28,3 815 23 ф 4 27 эО бэ 5 21 еб 231 1 Метанол Этанол зРезультаты выхода фосфолипидов представлены в табл. 1,П р и м е р 1, Синтез фссфатидил. метанола фосфолипазой Р в реакцион" ной среде с рН 5,6. Концентрация компонентов в реакционной среде: лецитин 5 мм, СаС 1, 40 мм кальция,ферментный препарат 0,04 г/л, метанол 120 мл/л, гексан 40 мл/л. Реакцию проводят при 54 С в течение 20 мин 10 (табл. 2), Выход целевого продукта составляет 12,4%. П р и м е р 2. Все экспериментыпроводят как в примере 1, но при рН 15среды 72. Выход целевого продуктасоставляет 10,2% (табл. 2).П р и м е р 3. Все операции про.водят как в примере 1 и 2, но при30 С. 20Данные представлены в табл. 2. 4П р и и е р 4. Все операции проводят как в примереи 2, но при45 ОС.Данные с другими спиртовыми акцепторами приведены в табл. 2,П р и м е р 5. Реакцию синтезафосфатидилметанола проводят как впримере 3, но продолжительность реакции 10-180 мин. Концентрация компонентов в реакционной среде: лецитин2,5 мм, СаС 1 40 мм кальция, ферментный препарат 0,04 г/л, метанол120 мл/л, гексан 20 мл/л,П.р и м е р 6. Реакцию синтезафосфатидилметанола проводят как впримере 3, используя ферментныепрепараты иэ различных источников,Данные приведены в табл. 3.Предлагаемый способ позволит получить новые виды фосфолипидов и увеличить выход на 10-30%.Т а б л и и а 11082374 Продолжение табл, 2 Выход фосфолипидов, Х от исходного лецитинапри количестве активатора, мл/л рНСпиртовый акцептор среды 120 5 С 30 С 45 С 5 С 30 С 45 С 5)б 7,4 30,6 45,0 7)2 6,6 32,5 38,5 Пропанол Т а б л и ц а 3 Выход фосфатидипметанола в зависимости от вида ферментного препаратапри рН 5)б Параметры Семянахлопчатника Листьякапусты Корнеплоды редькиПродолжительностьреакции, мин 30 20 30 50,3 30,3 34,2 54,3 Составитель Е. БуданцеваРедактор П.Макаревич Техред С.Легеэа Корректор Л. 1 овх Заказ 598/2 Тираж 589 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Выход продукта при 30 С 40ее5 С 30 С 45 С 8,3 32,5 36,6 7,8 28,5 33,3 7,5 31,4 25,0 7,1 29)2 26,3 19,5 24,2